p53作为乳腺癌潜在生物标志物和治疗靶点的研究进展

张伯阳，段秀庆

(哈尔滨医科大学附属第一医院乳腺外科,哈尔滨 150001)

p53基因及由其编码的p53蛋白一直被视为治疗癌症的关键，其不仅可通过细胞凋亡和永久不可逆的细胞衰老等方式促进癌细胞死亡，还可以参与DNA修复来抑制癌症的形成和进展。p53基因在正常细胞的编码、分裂和分化中起关键作用。但在包括乳腺癌在内大部分的人类癌症中，p53是突变率最高的基因[1-3]。该基因在30%～35%的浸润性原发乳腺癌中发生突变[4]。对于乳腺癌，p53突变的概率取决于该疾病的分子亚型，其中三阴性乳腺癌患者的突变率为80%，而在管腔A型的乳腺癌患者中突变率为10%，管腔B型的乳腺癌患者为30%，人表皮生长因子受体-2过表达型乳腺癌患者为70%[4-7]。基于这样高的患病率，以及最近发现的一些化合物[PRIMA-1(p53 reactivation and induction of massive apoptosis-1)、APR-246(a methylated derivative and structural analogue of PRIMA-1)等]可以重新激活突变型p53，并使其具有野生型构象。突变型p53很可能会成为乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌的生物标志物和(或)新的治疗靶点。现就p53作为乳腺癌潜在生物标志物和治疗靶点的研究进展予以综述。

1 p53突变与乳腺癌

p53是乳腺癌中最常见的突变基因。与其他癌症一样，绝大多数乳腺癌的p53突变属于错义突变，其中80%发生在p53基因的第5～8外显子上，大约10%发生于p53基因第4外显子上，6%发生于该基因第10外显子上，其第2、3、9和11外显子上则很少发生突变(<2%)[4-5]。在所有的p53基因突变中，绝大部分为单碱基取代，其余为小片段缺失和碱基插入[5-6]。突变发生的频率与乳腺癌的组织学和生化特征相关，如导管型乳腺癌发生突变的频率高于小叶型，淋巴结阳性者高于淋巴结阴性者，雌激素受体阴性者高于雌激素受体阳性者，人表皮生长因子受体-2阳性者高于人表皮生长因子受体-2阴性者[4-5]。同时，突变的发生率还取决于癌症的分子亚型，其在三阴性乳腺癌中发生率最高，在管腔A型乳腺癌中发生率最低。而突变的类型似乎也取决于癌症的分子亚型，相较于其他类型的乳腺癌，截短突变在BRCA1突变和三阴性乳腺癌中更为常见[7]。且p53的突变在一些乳腺癌中已被证明是克隆性的早期事件[4,8-9]。研究表明，10%～30%的导管原位癌存在p53突变[10-11]，且相匹配的原位癌和浸润性癌之间的p53突变状态具有一致性[9]。因此，乳腺癌中的p53突变可以发生在导管被浸润之前。由于在同一肿瘤的原位及其邻近的浸润部分中发现了完全相同的突变，所以两种类型的病变很可能具有共同的起源。虽然导管原位癌中存在p53突变，但迄今尚未在乳腺上皮增生中检测到[11]。这一发现证明了p53在非侵袭性乳腺肿瘤进展中的生物学作用，同时也为其能够作为乳腺癌生物标志物提供了有力的证据支持。

2 突变型p53在乳腺癌诊疗中的作用

2.1作为乳腺癌的生物标志物 现已有一些对于突变型p53基因/蛋白过度表达乳腺癌患者潜在预后及其治疗效果的相关研究[12-15]。大多数早期临床研究均使用免疫组织化学方法检测p53蛋白，因为正常p53蛋白的半衰期很短，难以检测，而突变基因所编码的蛋白非常稳定，并在癌细胞中积累。突变型p53蛋白相对于野生型具有更高的稳定性是由多种因素导致，包括与稳定蛋白(热激蛋白90)的相互作用，突变型p53不能对双微体基因2(具有降解p53的作用)及其翻译后的产物进行诱导，如丝氨酸20和苏氨酸180的磷酸化[16]。由于突变型p53蛋白更易在肿瘤细胞内积累，所以只要通过免疫组织化学检测到p53蛋白就表明突变存在。然而，现已知某些类型的突变(p53的截短突变)并不会产生稳定的蛋白质。此外，在没有突变的情况下，野生型p53也可以产生稳定的蛋白，如通过各种应激作用[14-17]。虽然基因突变与蛋白质的稳定性之间缺乏严格的一致性，但从早年研究中可以发现，免疫组织化学检测到的p53蛋白与不良预后相关[12]。且直接检测到的p53基因突变也与患者不良预后相关[13-15]。

然而，评估p53基因突变或蛋白过表达患者预后的早期研究存在很多缺陷，包括回顾性设计、调查患者数量少、非均质样本的使用和使用不同方式的辅助治疗。此外，免疫组织化学检测采用不同的抗体检测突变型p53，用不同的临界值将免疫组织化学评分高与低的患者分离开。一项大型随机对照试验回顾性研究了p53基因突变或蛋白过表达对乳腺癌患者预后的影响。其中一份报告，对参与两项随机试验(国际乳腺癌研究小组试验Ⅷ和Ⅸ)的1 113例淋巴结阴性乳腺癌患者进行了p53检测，并分别对行内分泌治疗和化疗联合内分泌治疗患者的预后进行对比[18]。结果显示，雌激素受体阳性伴p53蛋白高表达患者的预后较差，而雌激素受体阴性伴p53蛋白高表达患者的预后良好。上述试验证明，p53的表达与无病生存期和总生存期之间的关系似乎依赖于雌激素受体的状态，虽然其具体机制尚不清楚，但却为p53作为生物标志物来预测患者的预后提供了有力证据。

另一项Ⅲ期临床试验[CALB(cancer and leukemia group B)9344]显示，淋巴结阳性患者的高p53蛋白水平预示辅助使用环磷酰胺和阿霉素或单独使用阿霉素预后更差[19]。在欧洲癌症研究与治疗组织10994试验中，学者发现存在p53突变的患者在使用蒽环类或紫杉烷类方案治疗后预后较差[20]。且在这项试验中，p53的突变状态无法从基于紫杉烷的治疗和基于蒽环类的治疗方案中选择出优先受益的患者。此外，在 BIG(breast international group)02-98Ⅲ期临床试验中，突变型p53对淋巴结阳性接受阿霉素有或没有多西紫杉醇的患者缺乏预测能力[21]。以上试验说明，p53对化疗患者的预后有一定的预测作用，但在治疗方案的选择上尚存在争议。

Silwal-Pandit等[5]使用完整的外显子组测序方法将是否存在p53突变与患者的预后联系起来。结果发现在所有患者中，突变型p53的存在与特定的乳腺不良事件和总生存率相关。而只有特定分子分型的预后受突变影响，如人表皮生长因子受体-2过表达型和管腔B型乳腺癌死亡率的增加与突变型p53有关，而管腔 A型乳腺癌不受影响[5]。Fountzilas 等[22]报道，p53突变可以预示管腔A/B型乳腺癌和三阴性乳腺癌患者的不良预后，而不能预示人表皮生长因子受体-2过表达型乳腺癌患者的不良预后。随后的研究发现，p53突变的存在预示了曲妥珠单抗治疗的收益[22]。因此，p53能否预测不同分子分型乳腺癌患者的预后尚存在争议。

目前，不推荐根据p53基因的突变状态或免疫组织化学测量出的蛋白质结果来确定乳腺癌患者的预后或预测药物疗效。虽然突变的存在与不良结果有关，但这一结论可能仅限于特定分子亚型的乳腺癌患者或接受特定治疗方式的患者且存在争议。此外，不同的p53突变在乳腺癌的形成和进展中有不同的作用，因此其可能在预测患者的预后和(或)治疗效果方面产生不同的影响。然而，使突变型p53作为乳腺癌生物标志物并通过其预测患者预后的难点为其存在不同的分子亚型和旁系同源物[23]。如存在p53γ的乳腺癌患者，与野生型p53的患者具有相似的总生存期[24]。另有研究发现，p53β的表达对突变型p53肿瘤患者具有保护作用[25]。

2.2作为乳腺癌的治疗靶点 作为乳腺癌的治疗靶点，突变型p53具有几个重要特征。①p53是乳腺癌中最常发生突变的基因。与雌激素受体/孕激素受体阳性或人表皮生长因子受体-2阳性乳腺癌患者不同，三阴性乳腺癌患者缺乏有效的靶向治疗[26]。由于缺乏靶向治疗及三阴性乳腺癌本身的强侵袭性，三阴性乳腺癌患者的预后往往较差。②在将近90%的乳腺癌脑转移患者中存在p53突变[27]。对于转移至该器官的患者，目前没有有效治疗方法。③在某些乳腺癌中，p53的突变通过克隆存在于乳腺癌所有恶性细胞中。因此，克隆突变是比亚克隆或分支突变更好的癌症治疗靶点[8]。虽然从理论上讲，p53是治疗癌症的一个有效靶点，但突变型p53一直没有相关的有效靶向药物。然而这种情况正在发生改变，因为最近已有一些化合物被证明可以重新激活突变型p53，恢复其野生型特性，并诱导临床前肿瘤模型中表达的突变型p53，使其具有抗癌活性[28-30]。这些化合物，如3-奎宁环酮衍生物、PRIMA-1、APR-246、PK11007、PK7088、COTI-2(critical outcome techonologies inc)等可以使突变型p53再次活化，现已被应用于乳腺癌临床前模型进行潜在的抗癌活性研究。

3 突变型p53的潜在靶向药物

3.1PRIMA-1和APR-246 PRIMA-1是在筛选低分子量化合物库(美国国家癌症研究所多样性分集)后确定，因为它能恢复突变型p53的野生型特性[31]。在测试的大约2 000种化合物中，发现名为PRIMA-1的化合物可以恢复突变p53蛋白的野生型特性，如序列特异性的DNA结合和诱导细胞凋亡的能力[31]。PRIMA-1通过添加一个甲基来使其促细胞凋亡活性和细胞膜通透性增强，从而产生了化合物PRIMA-1 MET即APR-246[32]。Liang等[33]最早发现，PRIMA-1能抑制突变型p53乳腺癌细胞的生长。且他们认为，PRIMA-1能抑制突变型p53细胞系(BT-474、HCC-1428和T47-D)的活力，但对表达野生型p53的细胞系(MCF-7细胞、正常乳腺细胞或内皮细胞)的活力没有影响。通过特异性构象的p53抗体荧光染色显示，PRIMA-1可以将突变型p53转化为其野生型构象[33]。可见，对肿瘤生长的抑制似乎是通过诱导细胞凋亡、抑制血管内皮生长因子和诱导雌激素受体β实现。

与PRIMA-1相似，APR-246在临床前模型中也被证明可以抑制乳腺癌细胞的增殖，同时癌细胞对APR-246的反应与突变型p53或高内源性p53蛋白水平显著相关，而APR-246的反应与雌激素受体状态、人表皮生长因子受体-2状态或所研究的细胞系的分子亚型无关[34]，表明突变型p53或高水平的p53蛋白可能是癌细胞对APR-246是否有反应的预测生物标志物，且很少受其他因素影响。除抑制细胞增殖外，APR-246还可诱导突变型p53乳腺癌细胞系的细胞凋亡和减少其迁移[34]。

APR-246与突变型p53结合并重新激活突变型p53的能力得到证实，同时它也被发现能激活其旁系同源基因(p63和p73)[35-36]。此外，APR-246与几种临床使用的抗癌化合物类似[37]，其被证明可以减少谷胱甘肽的形成并增加活性氧的产生[38-39]。然而，APR-246在减少细胞谷胱甘肽方面较多种细胞毒性药物(紫杉醇、表柔比星、顺铂、伊立替康和5-氟尿嘧啶等)更有效[39]。因此，APR-246可通过多种机制诱导其自身抗癌作用。

虽然尚未在乳腺癌患者中进行调查，但APR-246已在血液系统恶性肿瘤和前列腺癌患者中进行了Ⅰ期临床试验[40]。据报道在这项早期临床试验中，APR-246耐受性良好，最常见的不良反应为疲劳、头晕、头痛和意识模糊。

可见，PRIMA-1和APR-246不仅能特异性地抑制突变型p53细胞系来源的乳腺癌细胞的生长，还具有多种抗癌机制及不良反应较少等特点。这些特点充分地显示了其作为突变型p53靶向药物的潜力。

3.2PK7088 与PRIMA-1和APR-246重新激活不同形式的突变型p53蛋白不同，吡唑类化合物PK7088能与Y220C突变的p53蛋白结合。Y220C突变会使p53蛋白的表面产生一个裂缝，破坏其稳定性，而PK7088可以附着在这个裂缝上[41]。PK7088与Y220C突变的蛋白结合可以提高其熔点。熔点的提高导致突变型p53蛋白折叠的增加，从而使其具有野生型构象，并恢复其一些野生型的转录活性。同时，PK7088结合Y220C突变的细胞后，p53靶基因、p21和NOXA的表达增加，从而使细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。然而，其潜在抗癌活性还需进一步研究。

3.3PK11007 另一种用于研究抗乳腺癌细胞活性的抗p53化合物是2-磺胺嘧啶分子PK11007。与APR-246一样，PK11007能稳定并重新激活突变型p53[42]。它们的另一个相似之处为能提高活性氧形成的能力[42]。与APR-246重新激活突变型p53的能力一样，相较于野生型p53乳腺癌细胞系，PK11007被证明能优先诱导突变型p53乳腺癌细胞的凋亡并抑制其生长和迁移[43]。另有研究发现，PK11007对TN细胞系生长抑制的敏感性高于非TN细胞系[42]。但迄今为止，PK11007还没有在动物模型中进行抗癌活性测试。

3.4COTI-2 COTI-2是通过CHEMSAS®的专有计算平台发现的一种缩氨基硫脲化合物。CHEMSAS®采用药理学方法统计建模，药物化学和机器学习相结合的方法来鉴定抗癌化合物[44]。临床前研究表明，COTI-2对广泛的癌症细胞系和异种移植模型均具有抗癌活性，包括MDA-MB-231乳腺癌细胞系的异种移植模型[44]。据Salim等[44]报道，在所研究的动物模型中，COTI-2具有良好的耐受性，没有明显的患病率或体重下降表现。虽然COTI-2似乎通过重新激活突变型p53和抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路发挥作用。但有关于COTI-2的具体作用机制仍需进一步研究。

4 小 结

虽然突变型p53作为乳腺癌生物标志物的潜力已被广泛研究，但突变蛋白的测定尚未应用于临床。且针对不同突变类型p53特异性抗体的应用[45]将让人们对突变型p53生物标志物潜力的研究愈发重视。与其作为生物标志物的作用相反，最近人们才开始将突变蛋白作为治疗乳腺癌的靶点。最近鉴定出的几种能够重新折叠并重新激活突变蛋白的化合物，将会增加人们对作为靶点的突变型p53的研究。因此，重新激活突变型p53对三阴性乳腺癌患者可能尤为重要。未来，需进一步确定PRIMA-1、APR-246、PK11007、PK7088和COTI-2等药物对不同p53突变及与非p53蛋白结合的有效性。