血红素加氧酶1对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

杨 诺，李 文

(1.首都医科大学第一临床医学院，北京 100069； 2.首都医科大学基础医学院细胞生物系，北京 100069)

缺血再灌注损伤是一种常见的病理反应，指组织或器官因血管局部或完全阻塞导致一定时间的缺血，血流恢复后对组织或器官造成的损伤[1]。肝脏是生物体的生化工厂，耗能量大，其功能很大程度上依赖氧气的供应，容易受缺血或缺氧的影响。肝脏缺血再灌注损伤指在缺血前提下，肝脏血流恢复后组织损伤加重，甚至造成不可逆损伤的现象。局部缺血根据缺血发生时的温度分为热缺血(37 ℃)和冷缺血(4～7 ℃)[1]。临床上，心肌缺血、休克、创伤和手术中可观察到热缺血，肝切除和肝脏移植术中冷缺血更为常见。肝脏缺血再灌注损伤是肝移植术后肝功能障碍和肝衰竭的重要原因，也见于肝脏部分切除术、出血性休克等多种临床病理过程和肝脏手术过程[2]。近年来，减轻移植肝缺血再灌注损伤一直是临床关注的热点。有研究表明，血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1作为内源性防御分子，通过抗氧化、抗凋亡、抗炎症、促自噬等作用发挥对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，同时对脂肪肝的缺血再灌注损伤也有保护作用[2]。现就HO-1对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用予以综述。

1 肝脏缺血再灌注损伤机制

1.1细胞内钙超载 生理情况下，细胞内维持稳定的钙离子浓度。肝脏缺血时，组织处于缺血、缺氧状态，细胞内ATP迅速消耗，无氧酵解增强，乳酸等酸性代谢物积累，同时线粒体的氧化磷酸化能力下降，导致代谢性酸中毒。此时，ATP依赖的钠钾ATP酶在细胞膜内的活性降低，导致细胞内钠离子浓度升高以及钠离子和钙离子的反向转运增强；此外，缺血和缺氧会增加细胞膜的渗透性，钙离子进入细胞增多，同时线粒体、内质网膜结构破坏，导致细胞内钙超载[3]。钙超载可通过多种机制引起肝损伤。钙超载可引起肝细胞线粒体功能障碍，ATP合成减少，线粒体水肿，线粒体膜通透性改变引起凋亡信号溢出，激活胱天蛋白酶级联反应，导致细胞凋亡或坏死；细胞内钙离子增多可以激活磷脂酶类，损伤细胞膜结构；细胞钙超载还可激活某些ATP酶，导致细胞高能磷酸盐水解，释放出大量氢离子，加重细胞酸中毒。

1.2氧自由基(oxygen free radicals，OFR)损伤 OFR是以氧为中心的自由基，包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基等。机体生理状况下能够不断产生并且清除OFR，使其处于动态平衡状态[4]。OFR的大量产生是肝脏缺血再灌注损伤的关键环节。缺血时细胞内ATP减少，膜泵功能障碍，钙离子进入细胞后增强钙依赖性蛋白酶活性，促进黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶；同时，细胞内氧分压低，ATP的降解产物次黄嘌呤大量堆积[5]。再灌注时，大量分子氧进入，黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸的过程中产生大量OFR。此外，由于再灌注时线粒体氧化磷酸化功能障碍而形成较多的OFR，再灌注激活库普弗细胞、中性粒细胞的吞噬作用，其耗氧量显著增加，呼吸爆发，生成大量OFR。OFR使膜脂质过氧化增强，破坏细胞器膜结构，进而引起溶酶体、微粒体及线粒体破裂，从而直接损伤细胞，并对蛋白质、核酸、胶原和多糖等有毒性作用。

1.3炎症反应 再灌注早期库普弗细胞活化和晚期中性粒细胞活化介导的炎症反应是肝脏缺血再灌注损伤的重要环节。再灌注早期，库普弗细胞在Toll样受体(Toll like receptor，TLR)的参与下，激活并上调介导炎症反应的细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，白细胞介素(interleukin，IL)-1，对触发炎症级联反应有重要作用[6]。库普弗细胞的产物可以活化和聚集CD4+T淋巴细胞，损伤肝细胞、肝窦内皮细胞，并导致微循环障碍[7]。此外，缺血产生的大量趋化因子使中性粒细胞生成、并向肝脏聚集和活化，再灌注时中性粒细胞继续大量聚集而加重损伤。激活的中性粒细胞产生大量的OFR，并分泌大量炎症细胞因子等损伤肝组织，导致肝功能障碍[4]。

1.4微循环障碍 肝血窦内皮细胞对缺血再灌注损伤敏感，缺氧可引起内皮细胞能量代谢失衡和细胞凋亡。再灌注过程中，增多且激活的中性粒细胞黏附在血管内皮细胞上，易嵌顿、堵塞微循环血管，并在细胞因子P-选择素的作用下，大量血小板聚集、黏附于缺血组织，形成微血栓。再灌注时缺血区无法得到充分的血液灌注，此现象称为无复流现象。内皮细胞功能障碍引起血管收缩舒张失调，肝脏微循环功能障碍会加重肝脏的缺血缺氧症状，引起肝窦内皮细胞死亡，造成肝组织的不可逆损伤。

1.5细胞凋亡和坏死 线粒体膜通透性的改变可以引起凋亡信号的溢出，导致程序性细胞死亡或坏死。细胞缺血期间，由于ATP缺乏，物质转运受到影响，产生的有毒代谢物不能及时转运，导致细胞肿胀。再灌注期间，ATP合成不足、活性氧大量产生及炎症损伤都会导致细胞坏死或凋亡[3]。

2 HO概述

HO是所有真核生物细胞内普遍存在的酶，是细胞内血红素分解的关键限速酶，通过有氧氧化将血红素降解为胆绿素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和游离铁，胆绿素又进一步被还原为胆红素。HO有3种同工酶，HO-1为可诱导型HO同工酶，HO-2和HO-3呈组成型大量表达。HO-2与HO-1的氨基酸序列仅有40%同源性，主要存在于大脑和睾丸组织。HO-3与HO-1的氨基酸结构仅有43%相似，与HO-2的氨基酸结构有90%同源性，催化血红素分解的活性较HO-1和HO-2明显减弱。

HO-1也称热激蛋白32，人类HO-1基因位于染色体22q12上，包含5个外显子和4个内含子。生理情况下，HO-1广泛表达于各种组织细胞的微粒体内，主要存在于脾脏和肝脏组织，脾脏中表达量最多，其余组织含量低。HO-1的表达具有可诱导性，多种引起细胞氧化应激的因素均可诱导其表达，如缺氧、缺血再灌注、内毒素、炎症因子等[8]。

3 HO-1对肝脏缺血再灌注损伤的保护机制

3.1抗氧化作用 HO-1氧化血红素需要消耗氧气，可在缺血再灌注过程中减少由氧气产生的OFR，起到抗氧化作用。Yun等[9]对肝脏缺血再灌注损伤过程中HO-1的表达和活性变化的研究发现，缺血1 h的大鼠肝脏，再灌注1 h后HO-1活性增加，4～6 h的HO-1活性最高，随后逐渐下降。HO-1信使RNA和蛋白的表达也在再灌注1 h后升高，再灌注6 h达到最高，随后下降。大鼠肝脏HO-1的变化趋势与肝功能丙氨酸转氨酶的变化趋势一致。HO-1诱导剂高铁血红素处理组较注射等量0.9%氯化钠注射液对照组血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平降低，超氧化物歧化酶表达增高，丙二醛含量降低，谷胱甘肽含量增加，同时Sestrin2(Sesn2)蛋白表达增加，肝脏组织学病变减轻；而HO-1抑制剂锌原卟啉处理组较注射等量0.9%氯化钠注射液对照组血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平增高，组织学病变加重，丙二醛含量升高，谷胱甘肽含量减少，表明HO-1对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用与抗氧化作用有关[10]。氧化应激时，多种转录因子(如核因子E2相关因子2、核因子κB，转录激活因子-1等)可以激活HO-1基因的表达[11]。如OFR通过促分裂原活化的蛋白激酶途径使核因子E2相关因子2磷酸化，启动HO-1基因转录，提高HO-1的表达量[12-13]。

血红素氧化产物胆绿素及其转化产物胆红素是体内的抗氧化剂，可起到抗氧化损伤的作用；胆红素可抑制细胞膜脂质过氧化，减轻OFR对血管内皮细胞和平滑肌细胞的损伤[8]。HO-1降解血红素卟啉环释放Fe2+，诱导铁蛋白合成，限制Fe2+参与Fenton反应，减少生成OFR，铁蛋白的抗氧化作用可抑制铁与过氧化氢反应，减少OFR的毒性作用[4]。

3.2抗凋亡作用 HO-1可通过多种途径抑制肝脏细胞凋亡，减轻再灌注时肝损伤。缺血后再灌注期间，HO-1可增加抗凋亡基因Bcl-2表达，抑制胱天蛋白酶3级联反应，从而减少细胞凋亡[14]。Wang等[15]对锌原卟啉处理小鼠的研究发现，HO-1表达下调，线粒体凋亡通路激活，引发胱天蛋白酶3级联反应，导致细胞凋亡，加重肝脏缺血再灌注损伤。HO-1可抑制肝脏缺血再灌注损伤时肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子受体1介导的凋亡信号，减少细胞凋亡。HO-1表达增加时死亡诱导信号复合体减少，肿瘤坏死因子受体1相关死亡结构域蛋白、Fas相关死亡结构域蛋白和胱天蛋白酶8表达降低，细胞凋亡受到抑制[16]。内质网是分泌蛋白质合成和折叠的细胞器，缺血再灌注时内质网出现应激，应激蛋白表达升高，促进细胞凋亡。HO-1还可降低肝脏缺血再灌注时内质网应激蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白的表达，可见HO-1可降低缺血再灌注时内质网应激引起的细胞凋亡[17]。

血红素氧化产物CO可活化p38促分裂原活化的蛋白激酶途径来抑制CD95/FasL介导的肝细胞外源性凋亡途径，也可通过调节促凋亡基因(如Bax、p53)与抗凋亡基因(Bcl-2)的表达发挥抗凋亡作用[18]。胆绿素可增加抗凋亡因子的表达，此外，重链铁蛋白也有抗凋亡作用。

3.3抗炎症作用 HO-1可抑制缺血再灌注时的炎症反应。肝脏缺血再灌注时，肝脏巨噬细胞HO-1表达增加，抑制炎症反应。肝脏缺血再灌注后，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等浸润减轻，肝脏炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)以及趋化因子CXCL-1和CXCL-2表达降低[19-20]。骨髓HO-1表达可以调节巨噬细胞的极化，使促炎M1型表达减少，抗炎M2亚型表达增多，从而发挥抗炎作用[21]。

HO-1的抗炎症作用与抑制天然免疫受体TLR2和TLR4信号通路的活化有关。HO-1激动剂钴原卟啉预处理的肝脏缺血再灌注后，TLR2、TLR4、IL-1受体相关激酶、TNF受体相关因子6的表达下降，信号通路相关激酶(如干扰素调节因子-3、p38促分裂原活化的蛋白激酶、人核因子κB抑制蛋白-α)的磷酸化水平下降，表明其可减弱缺血再灌注时天然免疫细胞的活化。有研究发现，在肝脏缺血再灌注中，HO-1通过HO-1-信号传导及转录激活因子3轴抑制TLR4介导的天然免疫炎症反应，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/PTEN信号通路，从而发挥抗炎作用[22]。腺病毒载体Ad-HO-1转染可以减轻肝脏缺血再灌注损伤，伴有信号传导及转录激活因子3的表达升高、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路激活和PTEN基因抑制。若预先使用磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂，则腺病毒载体Ad-HO-1转染不能减轻缺血再灌注造成的炎症反应，由此可见，TLR4-核因子κB途径受磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路的调节，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路可以促进TLR4-核因子κB活化，促进肝脏炎症反应[22]。

血红素的代谢产物胆绿素可调节血管内皮细胞黏附因子表达，减少肝脏缺血再灌注损伤的中性粒细胞浸润，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α及细胞间黏附分子-1的释放，还能够抑制补体系统，从而减轻炎症反应造成的损伤[8]。

低浓度CO可活化p38促分裂原活化的蛋白激酶途径调节巨噬细胞源性促炎分子，并促进抗炎细胞因子IL-10分泌，在缺血再灌注损伤中发挥抗炎症作用[18]。

3.4改善微循环 肝血窦内皮细胞易在缺血再灌注损伤中受损，引起微循环紊乱。血管HO-1可减少血小板向肝血窦内皮细胞的黏附和库普弗细胞的黏附，肝血窦内血小板流速增加[23]。

血红素的代谢产物CO可在一定程度上改善缺血再灌注过程的微循环，CO通过p38促分裂原活化的蛋白激酶途径和环鸟苷酸途径舒张血管平滑肌，改善微循环[18]。少量CO可减少白细胞在肝窦处的聚集，减少肝细胞损伤，并在一定程度上恢复微循环。

3.5促进细胞自噬 哺乳动物自噬是一种细胞内自我消化途径，在溶酶体内清除长寿蛋白、受损细胞器和畸形蛋白。自噬是氧化应激过程中细胞的一种适应机制，可通过降解细胞内容物来促进肝细胞生存，以维持ATP的产生并清除受损细胞器和蛋白聚集物[24]。研究发现，小鼠肝脏缺血1 h以及再灌注后1～4 h，自噬均受到抑制，表现为自噬标志物(膜型自噬微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ与胞质型自噬微管相关蛋白1轻链3-Ⅰ的比值)下降，p62蛋白水平升高，电镜下自噬体减少。肝细胞内钙离子浓度升高可抑制肝脏自噬，激活钙蛋白酶1和钙蛋白酶2，并降解自噬相关蛋白。Hemin预处理可以减轻肝脏缺血再灌注损伤，伴自噬水平提高，与HO-1抑制钙蛋白酶2活性有关。而锌原卟啉预处理可使肝脏缺血再灌注损伤增加，自噬受到抑制，表明诱导HO-1表达可以通过抑制钙蛋白酶2活性，提高自噬水平，保护肝脏缺血再灌注损伤[25]。肝脏缺血再灌注损伤模型中，缺血预处理可以减轻肝脏缺血再灌注损伤，其机制与肝细胞内HO-1生成增多以及细胞自噬增加有关，从而清除功能障碍的线粒体，降解错误折叠的蛋白质，抑制ROS的产生，减轻内质网应激反应并减少肝细胞凋亡、坏死[26]。多项研究发现，诱导核因子E2相关因子2/HO-1防御通路的激活，可增加细胞自噬，减轻肝脏缺血再灌注损伤[27-30]。

对小鼠原位肝移植模型的研究发现，体外存放20 h，并输注转染了Ad-HO-1的骨髓源性巨噬细胞的供肝移植，可以减轻移植后肝损伤，表现为肝脏功能改善，肝细胞凋亡减少，肝脏炎症细胞因子表达下降，肝细胞自噬增加；进一步研究发现，HO-1促进自噬保护移植肝脏的作用与激活沉默信息调节因子1有关，抑制沉默信息调节因子1活性可以抑制自噬，减弱HO-1过表达对肝移植的保护作用[31]。

3.6其他保护途径 在肝脏缺血再灌注损伤中，HO-1可以通过调控线粒体质量控制,减轻肝脏缺血再灌注损伤，如增加线粒体DNA含量和线粒体转录因子A蛋白表达、增强线粒体的生物合成、促进Parkin蛋白的表达及线粒体自噬、减少缺血再灌注时线粒体分裂相关蛋白Drp1的表达、抑制线粒体分裂以及促进线粒体动态平衡[32]。线粒体质量控制与激活磷酸甘油酸变位酶5信号通路有关。

HO-1能诱导缺氧诱导因子-1α、趋化因子CXCL12a和血管内皮生长因子的表达，动员血管内皮祖细胞从骨髓向外周血释放，并向肝脏内迁移，促进肝内和肝外胆道周围血管丛损伤的修复和再生，有助于缺血再灌注损伤后的修复[33]。

4 小 结

HO-1及血红素的代谢产物胆绿素、CO、Fe2+在细胞抗氧化损伤、抗凋亡坏死、抗炎症反应、改善微循环等方面具有重要作用，在减轻肝移植后肝损伤方面具有巨大的应用潜力，但其大规模应用尚需要解决很多问题。目前，尚未找到诱导HO-1表达的最佳方法。如体内腺病毒介导的HO-1基因转移，由于没有组织表达特异性，会产生非特异性诱导的HO-1，可能给机体带来不利影响。HO-1的细胞保护效应有一定的剂量范围，超过范围可能有细胞毒性。钴原卟啉诱导全身HO-1过量表达可增加肝损伤，加重细胞坏死和纤维化。库普弗细胞是肝脏HO-1的主要来源，HO-1的表达增加也可能加重库普弗细胞的活化，从而增加炎症和成纤维介质的形成。

血红素代谢产物CO可作为缺血再灌注损伤的治疗，但需注意CO用量，高水平CO吸入对身体有害，甚至危及生命。胆绿素也可用于临床缺血再灌注损伤的治疗，但过多胆绿素可代谢生成胆红素，胆红素过多会引起神经毒性，并作为溶菌剂与红细胞膜结合，影响机体正常生理活动。综上所述，HO-1及其代谢产物对肝脏缺血再灌注损伤具有多方面的保护作用，但将HO-1及血红素代谢产物应用于临床治疗时，需同时考虑其细胞保护性和细胞毒性，谨慎选择治疗方案。