牙髓干细胞来源条件培养基促进组织修复与再生的研究进展

秦 杰，王晓春

(哈尔滨医科大学附属第四医院口腔科，哈尔滨 150001)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不仅具有自我更新能力，还具有分化成多种细胞系的潜能，可从骨髓、脂肪组织、外周血、牙髓等成体组织以及胎盘、脐血、脐带等围生期组织中分离[1-3]。骨髓是临床最常应用的MSCs来源，但采集过程痛苦且具有侵袭性，而牙髓的侵入性较低，逐渐成为MSCs的来源。牙髓为结缔组织，是组织再生的最佳选择。每个牙髓都可以提供大量的牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，其获取方便，且适合低温保存。

MSCs的治疗潜力在很大程度上取决于细胞外环境中分子和因子的释放，包括具有旁分泌活性的可溶性因子(蛋白质、核酸、脂类)和胞外囊泡[4]。从骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 中提取的可溶性因子在再生医学中得到了广泛的研究和应用。胞外囊泡也逐渐引起越来越多的关注，可分为凋亡体、微粒子和外泌体[5-6]。有证据表明，胞外囊泡主要负责MSCs的再生，并保留了其母细胞的归巢特性[7]。DPSCs胞外囊泡主要存在于DPSCs条件培养基(conditioned medium，CM)中。现就DPSCs-CM促进组织修复与再生的研究进展予以综述。

1 DPSCs

DPSCs具有高增殖潜能，可从附着于塑料培养皿的牙髓组织碎片中分离并扩增，并可在不中断细胞增殖的情况下转移到其他培养皿。人血小板提取物是临床大规模制造扩增DPSCs的最佳生长补剂。目前，DPSCs的鉴定标准为：①具有依附性；②具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的能力；③在体外表达间充质标志物(CD29、CD90、CD105、CD73和CD44)，但不表达造血谱系标志物(CD14、CD34、CD45)[8]。DPSCs属于MSCs，可分化为神经外胚层细胞、脂肪细胞、成牙细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞等中胚层来源细胞，可见，DPSCs具有可塑性[3]。有研究证明，与BMSCs相比，DPSCs的增殖和矿化诱导能力较大[2]。因此，DPSCs在组织再生疗法中的广泛应用成为研究的热点。

2 DPSCs-CM

DPSCs外环境中营养物质的释放决定了其治疗的潜能，其营养物质主要存在于CM中，主要包含大量的细胞因子、趋化因子、生长因子以及细胞外囊泡。与细胞治疗相比，DPSCs-CM不仅可促进组织的修复与再生，还具有高特异性、无细胞毒性和低免疫原性的特点，弥补了细胞治疗的缺陷，有望成为代替DPSCs的治疗新手段。

2.1DPSCs-CM与牙齿组织损伤 龋病和牙髓病是常见的口腔疾病。对于不可逆性牙髓病主要采用根管治疗术，其主要目的是去除和控制感染。但由于失去了牙髓组织的营养供应，根管治疗术后的牙体组织变脆易导致牙体折裂，还可出现牙齿变色影响美观等现象。因此，DPSCs-CM的作用显得尤为重要。

DPSCs-CM可促进成纤维细胞、成肌细胞、DPSCs等细胞的增殖和迁移，其作用效果较BMSCs-CM和脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)-CM显著[9-11]。Hayashi等[12]比较DPSCs-CM、BMSCs-CM和ASCs-CM的再生能力的研究发现，DPSCs-CM诱导再生组织的区域更多，再生区域的细胞密度更大，其促进作用可随细胞微环境的变化而变化。Nakayama等[9]发现，经粒细胞集落刺激因子处理的DPSCs-CM对细胞迁移、免疫调节、抗凋亡、内皮分化和神经突延长均有较强的促进作用。化学试剂乙二胺四乙酸与DPSCs-CM结合可增强细胞增殖和迁移以及成牙细胞的分化能力，并强调了DPSCs-CM对成牙细胞分化的有益作用[10]。DPSCs-CM中高水平的细胞因子(如神经营养素-3和骨形态发生蛋白)的促进作用可以参与成牙细胞分化[13]。DPSCs向成牙细胞分化过程中，神经营养素-3的表达上调，可加速牙髓细胞的分化[14-15]。骨形态发生蛋白是发育过程的多效功能转化生长因子，可促进成牙细胞分化[16]。Huang等[17]指出，体内DPSCs-CM对成牙细胞分化具有促进作用，尤其是DPSCs-CM中的外泌体。外泌体由DPSCs分泌，参与细胞间通讯以及受损组织的保护和再生[18]。对异位牙移植模型的研究发现，与单独DPDCs诱导组相比，DPSCs-CM来源外泌体组的牙源性分化基因(牙本质涎磷蛋白)的表达更强烈[17]。综上所述，与BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM在牙胚细胞分化方面的效率更高，为DPSCs-CM在牙组织再生方面的应用开辟了广阔的前景。

2.2DPSCs-CM与血管疾病 新血管生成和缺血范围是评估缺血类疾病危险性的主要因素。目前，治疗缺血性疾病的方法较多，但尚未找到有效的治疗方法。DPSCs-CM可以对内皮细胞和血管生成产生影响。有研究发现，与BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM的抗凋亡能力较强，此抗凋亡能力可应用于脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和肌细胞[9,19-20]。DPSCs-CM主要通过促进内皮细胞分化或管状网络形成来诱导肌细胞、脐静脉内皮细胞和成纤维细胞等细胞的血管生成，这种血管生成的刺激主要与CM中血管生成因子[如单核细胞趋化因子-1、血管内皮生长因子、白细胞介素(interleukin，IL)-8、胰岛素样生长因子、基质金属蛋白酶-3、粒细胞集落刺激因子]的存在有关[21-22]。将注射DPSCs-CM的离体牙根移植入裸鼠皮下的体内培养发现，与注射BMSCs-CM和ASCs-CM的离体牙组相比，DPSCs-CM可促进更多新生血管的形成[12]。Iohara等[19]的研究发现，DPSCs-CM可使大鼠后肢缺血区域的血流增加，并形成高密度血管。综上所述，DPSCs-CM可促进血管新生和减少缺血，对心血管和缺血性疾病发挥积极作用。

2.3DPSCs-CM与骨关节疾病 肌肉骨骼和骨关节疾病可影响患者的日常生活，但目前尚未找到有效的治疗方法[23]。关节炎症疾病(如关节炎)的对症治疗(服用消炎药物)会引起许多不良反应，DPSCs-CM所包含的调节炎症环境的因子可有效治疗关节炎症。

体外DPSCs-CM可促进巨噬细胞极化表型转换，使其处于M2型巨噬细胞抗炎状态。在DPSCs-CM处理的细胞中，M1型巨噬细胞的特异性基因(如肿瘤坏死因子、IL-1、IL-6、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9)表达下调，而M2型巨噬细胞的特异性基因(精氨酸酶-1和缺氧诱导分化因子-1)表达上调[24]。DPSCs-CM具有诱导抗炎环境的能力，可增加IL-10的表达[25]。此外，DPSCs-CM还具有成骨分化的潜能，可用于骨缺损(如骨不连)的再生。Alkharobi等[26]发现，DPSCs-CM中的生长因子可使DPSCs分化为成骨样细胞，并检测到胰岛素样生长因子结合蛋白-2和胰岛素样生长因子结合蛋白-3两种特异性因子的存在。DPSCs分化为成骨样细胞后，胰岛素样生长因子结合蛋白-2表达水平升高，而胰岛素样生长因子结合蛋白-3表达水平降低，可见，胰岛素样生长因子结合蛋白-2和胰岛素样生长因子结合蛋白-3以及DPSCs-CM均参与了DPSCs分化的调控。Ma等[27]通过细胞年龄对DPSCs-CM性能影响的研究发现，幼年DPSCs-CM诱导的成年供体DPSCs增殖增强，但成骨分化能力下降；而成年DPSCs-CM诱导的幼年供体DPSCs增殖减弱，但成骨分化能力增强。由此可见，DPSCs-CM对减少与骨关节疾病有关的组织破坏和诱导新的成骨组织形成有重要的作用，可为肌肉、骨骼和关节疾病的治疗提供新的选择。

2.4DPSCs-CM与神经疾病 神经系统疾病的种类很多，如神经退行性疾病(帕金森病、阿尔茨海默病)、周围神经损伤、缺血性脑损伤等，但目前尚无有效的治疗神经系统疾病的方法。一项体外研究发现，DPSCs-CM可诱导神经母细胞瘤细胞向神经元细胞分化，并招募神经元细胞，可将DPSCs-CM的治愈能力用于脑再生治疗方法的开发[28]。

在阿尔茨海默病的体外模型中，DPSCs-CM通过抑制神经母细胞瘤细胞的凋亡，提高细胞活力，起到神经保护的作用[29]。DPSCs-CM可以使神经母细胞瘤细胞中B细胞淋巴瘤因子-2 (一种抗凋亡蛋白)的表达显著升高，凋亡启动子蛋白表达显著降低。有研究发现，DPSCs-CM含有脑啡肽酶，能够降解诱导细胞凋亡的β-淀粉样肽[29]。与BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM中可以检测到更多的神经保护因子、血管内皮生长因子和抗凋亡因子。DPSCs-CM提供的神经保护环境可为脑缺血提供神经保护治疗。Song等[30]对缺氧缺血性脑损伤体外模型的研究发现，DPSCs-CM可通过减少反应性胶质化和促炎细胞因子(IL-1β)的表达，对星形胶质细胞起保护作用，但BMSCs-CM并未引起类似的结果。此外，DPSCs-CM可通过抑制IL-1β和激活IL-10的表达产生抗炎作用，并伴随行为测试的显著恢复，表明DPSCs-CM可改善损伤的脑部功能。周围神经损伤的体外模型的研究也报道了DPSCs-CM的神经保护作用。Yamamoto等[31]对移植入DPSCs的大鼠坐骨神经缺损模型的研究发现，有髓纤维可在移植缺损处再生，但DPSCs并未直接分化为施万细胞表型，而是在施万细胞附近定位诱导多种营养因子(如脑源性神经营养因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子)，营养因子使施万细胞凋亡减少，促进轴突再生以及血管生成。Mead等[32]对视网膜神经损伤体外模型的研究显示，与BMSCs-CM或ASCs-CM相比，DPSCs-CM可保护神经，并可促进由神经保护因子和促血管生成因子介导的神经生成。

综上所述，与BMSCs-CM、ASCs-CM等相比，DPSCs-CM含有较多的神经保护因子和促血管生成因子。DPSCs-CM在阿尔茨海默病、帕金森病、缺氧缺血性脑损伤、周围神经损伤等神经系统疾病的组织保护和再生中起主导作用，为神经损伤类疾病的治疗提供了新的思路[29-30]。

2.5DPSCs-CM与实体器官衰竭 实体器官(肝脏或肺脏)衰竭可导致机体功能衰竭，常危及生命。衰竭器官的功能细胞由纤维化组织取代，并与炎症反应相关，因此，抑制炎症是治疗的关键因素。

与BMSCs-CM相比，DPSCs-CM可以促进肝细胞增殖并清除慢性炎症。丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶与肝功能显著相关。与其他器官相比，丙氨酸转氨酶在肝脏中表达水平更高，天冬氨酸转氨酶与肝脏活动有关，而碱性磷酸酶与细胞增殖有关。血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶水平升高是肝细胞破膜释放酶的重要标志。Kumar等[33]对DPSCs-CM和BMSCs-CM中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶进行对比分析发现，3种酶在DPSCs-CM中的检测结果较高，并可促进肝细胞增殖。DPSCs-CM可诱导抑制纤维化标志物(如α-平滑肌肌动蛋白)的表达，并可通过诱导巨噬细胞促炎表型向抗炎表型转化来减少纤维化，同时还可抑制促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、IL-1β)的表达，进一步促进了受损组织的再生[34]。生长阻滞特异性蛋白-6与肝再生有关，其存在于DPSCs-CM中，但不存在于BMSCs-CM中，故BMSCs-CM中未观察到以上反应。由此可见，DPSCs-CM旁分泌机制对实体器官纤维化具有重要的治疗作用，DPSCs-CM可能成为治疗肝脏或脏肺等实质器官衰竭的有效工具。

2.6DPSCs-CM与糖尿病 糖尿病是机体胰岛素作用或分泌受损而引起的慢性代谢性疾病。使用分化的干细胞或胰岛β细胞移植来补充丢失的产胰岛素细胞，可能是替代传统胰岛素治疗糖尿病的新方法[35]。此外，糖尿病常导致严重的并发症，如周围神经病变、血管病变。手术治疗是目前糖尿病并发症的主要治疗方法。

DPSCs不仅具有向胰岛样聚集物分化的能力，还可以葡萄糖依赖的方式释放胰岛素[36-37]。DPSCs-CM可通过对胰岛β细胞的保护和增殖作用促进胰岛素分泌，并减少细胞死亡，改善体外糖尿病模型的高血糖状态，可见，DPSCs-CM对胰岛β细胞的生存和功能都有影响[38]。Kanafi等[39]的研究证实，DPSCs-CM可使小鼠血糖达到正常水平。大量研究证明，DPSCs可通过旁分泌作用分泌神经生长因子、血管内皮生长因子，有助于减少糖尿病导致的周围神经病变和血管病变[19,31-32]。

DPSCs-CM治疗较DPSCs移植治疗的不良反应少，且不需要使用免疫抑制剂，可见DPSCs-CM是一种更安全、侵入性更小的治疗糖尿病的方法，其治疗效果较BMSCs-CM更明显。但是，DPSCs-CM治疗糖尿病的具体临床作用机制和有效性仍有待进一步的研究。

3 小 结

DPSCs较其他组织来源的MSCs具有巨大的优势。口腔组织分离的MSCs来源于胚胎，是神经嵴源性细胞[40-41]。DPSCs可分化为中胚层，也可分化为非中胚层组织细胞(神经源细胞、肌源细胞、角化细胞、肝细胞、黑素细胞)，并表现出神经功能[3]。MSCs-CM进一步发挥了MSCs的再生诱导能力，DPSCs-CM也受到了广泛关注。DPSCs-CM在口腔医学领域的组织修复和再生具有巨大的应用潜力，其优越性将成为无细胞治疗和再生医学的新标准，并成为修复组织缺损与再生的新手段，期待DPSCs-CM的进一步临床研究和应用为再生医学做出贡献。