PTSD大鼠海马CA1区和前额叶皮层突触小泡蛋白的表达*

林 玲， 高 丽， 师瑞红

(河南医学高等专科学校生理教研室， 河南 郑州 451191)

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指个体经历、目睹或遭遇到一个或多个涉及自身或他人的实际死亡、受伤，或躯体完整性受到严重威胁，所导致的个体延迟出现并持续存在的一种精神障碍，以认知功能减弱为主要特征[1-2]，在临床上主要表现为病理性重视、持续性警觉性增高和回避[3]。PTSD已经成为严重威胁人类健康甚至是生命的重要疾病之一，近年来虽受到广泛关注，但其发病机制目前尚不十分清楚。有研究表明，在精神应激的过程中，多个脑区参与了对机体功能的调节，包括大脑皮质、海马(hippocampus，Hippo)、杏仁核和下丘脑等。以往有关PTSD及机制的研究主要集中在海马，但在前额叶皮层(prefrontal cortex，PFC)上的研究相对较少。本实验选择海马CA1区和PFC为共同靶点，通过行为学检测PTSD大鼠的学习记忆能力，免疫组化、Western blot和免疫荧光检测突触小泡蛋白(synaptophysin)的表达，探讨PTSD大鼠空间记忆损伤的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，SPF级，体质量180～220 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号: SCXK(湘)2011-0003。动物饲养环境：通风，自然光照环境，室温维持在(22±1) ℃。

1.2主要试剂 兔抗突触小泡蛋白多克隆Ⅰ抗购自Abcam；HRP标记的羊抗兔甘油 II 抗、FITC标记的羊抗兔荧光 II 抗、Triton X-100、 BSA和DAB显色试剂盒等均购于碧云天生物技术有限公司。

1.3实验仪器 Morris水迷宫(北京医学科学院药物研究所研制)；荧光显微镜和冰冻切片机(OLYMPUS);高速冷冻离心机(BECKMAN)；转膜仪和电泳仪(北京六一仪器厂)。

2 方法

2.1实验动物分组 实验动物随机分为正常对照(control)组和模型(model)组，每组18只。常规分笼饲养，每笼6只，采用国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，充足水分供应。

2.2PTSD动物模型的制备 按照文献[4]的方法，模型组大鼠遭遇单次延长应激(single prolonged stress, SPS)：禁锢2 h；强迫性游水20 min(水深40 cm、水温25 ℃)；休息15 min后乙醚麻醉至意识丧失。2组动物无干扰饲养，常规摄食饮水，饲养温度为18～22 ℃。

2.3行为学测试 造模完成之后24 h行Morris水迷宫实验,分为前5 d的定位航行实验与第6天的空间搜索实验：(1)定位航行实验：历时5 d，每天1次，记录大鼠找到水下平台的时间(即逃避潜伏期)，超过120 s找不到平台的，可引导其找到平台，成绩记为120 s。(2)空间搜索实验：实验第6天撤去水下平台，大鼠于固定象限面向池壁入水，记录120 s内平台所在象限的游泳时间和穿越平台的次数。

2.4免疫组化实验 水迷宫实验结束后各组取6只大鼠进行免疫组化实验。大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg)后，经4%多聚甲醛心脏灌注，快速取脑后固定，常规石蜡包埋，冠状切片，片厚3 μm，切片常规脱蜡，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，每次5 min,用枸橼酸盐缓冲液进行微波抗原修复，于新配制的0.3% H2O2溶液中室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min,滴加兔抗突触小泡蛋白多克隆抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗， DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察，摄片。应用ImageJ图像分析软件测定阳性细胞的平均积分吸光度值。

2.5Western blot实验 各组另取1/3大鼠(6只)在行为学实验完毕之后进行Western blot实验。实验大鼠在腹腔麻醉后快速取出全脑，冰浴分离出海马，RIPA充分裂解提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(Novagen)测定蛋白浓度。调节各组蛋白浓度统一为0.5 g/L，加2×SDS上样缓冲液，99 ℃变性10 min。每孔中加10 μL样品，Tris-SDS PAGE转印到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入抗突触小泡蛋白抗体4 ℃过夜。倾去 I 抗，TBST洗膜3次,每次15 min。分别加入滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG II 抗(1∶2 000)，置于摇床上摇动，室温下1 h；弃去II抗，TBST洗膜3次,每次15 min；ECL显色，凝胶成像分析系统成像，检测蛋白质印迹条带，Image J软件分析求得平均吸光度值，以目的条带与β-actin的吸光度比值表示目的蛋白的相对表达量。

2.6免疫荧光实验 各组取最后1/3大鼠进行免疫荧光实验。将各组大鼠灌注后取脑，置于4% 多聚甲醛溶液中过夜，经30%蔗糖溶液脱水后，用恒温(-20 ℃)冰冻切片机作冠状切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片脑片，切片经0.3% Ttiton X-100通透2 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min，10% BSA封闭1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。滴加突触小泡蛋白I抗，4 ℃条件下孵育过夜; 复温后0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。暗室加入FITC标记的羊抗兔 II 抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min, DAPI染核，防淬灭的封片剂封片，荧光显微镜下观察拍片，每张切片检测海马CA1区平均阳性细胞数和积分吸光度(integral absorbance,IA; IPP 6.0软件分析)。

3 统计学处理

所有实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，经SPSS 24.0处理，数据分析前经正态性分布检验，两组间均数的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同组别大鼠定位航行实验和空间搜索实验成绩的比较

Morris水迷宫实验结果显示，在定位航行实验中，从实验第2天开始到第5天，与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期均明显延长(P<0.01)。在空间搜索实验中，与对照组比较，模型组大鼠在目标象限的停留时间均明显降低(P<0.01)，穿越原平台位置的次数也明显减少(P<0.01)，见表1、2。

表1 2组大鼠逃避潜伏期的比较

**P<0.01vscontrol group.

表22组大鼠目标象限停留时间和穿越原平台次数的比较

Table 2.Comparison of the target quadrant stay time and the times of crossing the platform in the 2 groups (Mean±SD.n=18)

GroupTarget quadrant stay time (s)Times of crossing the platformControl58.72±6.3512.65±1.74Model42.56±7.43∗∗8.33±1.28∗∗

**P<0.01vscontrol group.

2 免疫组化实验检测2组大鼠海马CA1区和PFC突触小泡蛋白的表达

结果显示，在海马CA1区和PFC，胞浆内呈现棕黄色颗粒为突触小泡蛋白免疫反应阳性细胞；与对照组比较,模型组大鼠海马CA1区和PFC突触小泡蛋白的表达均显著减少，积分吸光度均显著降低(P<0.05或P<0.01),见图1。

3 Western blot实验检测2组大鼠海马和PFC突触小泡蛋白的表达

结果显示，与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区和前额叶皮层突触小泡蛋白的表达均显著减少(P<0.05或P<0.01),见图2。

4 免疫荧光实验检测2组大鼠海马和PFC突触小泡蛋白的表达

荧光显微镜下，海马CA1区和PFC的神经元胞浆内可见FITC标记的绿色荧光免疫反应阳性产物为突触小泡蛋白。对照组大鼠突触小泡蛋白阳性细胞荧光染色强，模型组大鼠突触小泡蛋白阳性细胞荧光染色浅,见图3A、B。在海马和PFC，与对照组比较，模型组大鼠突触小泡蛋白阳性细胞数均呈显著减少，积分吸光度呈显著降低(P<0.05或P<0.01)，见图3C、D。

Figure 1.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by immunohistochemical staining. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1免疫组化实验检测2组大鼠海马CA1区和PFC突触小泡蛋白的表达

Figure 2.The expression of synaptophysin in the CA1 region of hippocampus and PFC of the rats in the 2 groups was detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2Westernblot实验检测2组大鼠突触小泡蛋白在海马CA1区和前额叶皮层的表达

讨 论

正常机体能够对各种环境因素的复杂变化作出适应性反应，以适应各种应激，如果适应能力下降就会导致各种疾病。PTSD是一种典型的应激障碍性疾病，其临床表现以再度体验创伤为特征,并伴有情绪的易激惹和回避行为,是一种创伤后心理失衡状态[5-6]。

在本研究中，我们利用SPS构建PTSD大鼠模型，在Morris水迷宫实验中，模型组大鼠的逃避潜伏期较对照组明显延长，撤去水下平台之后，模型组大鼠目标象限游泳时间明显减少，穿越原平台位置的次数也明显减少，说明了PTSD大鼠的空间记忆能力明显减退，这些都符合PTSD 的临床特征，说明模型复制成功。

本课题组既往的研究表明，PTSD大鼠学习记忆能力减退与海马5-HT1A受体表达明显增加以及学习记忆相关蛋白PSD-95的表达明显减少密切相关[7]。

Figure 3.The expression of synaptophysin in CA1 region of hippocampus (A) and PFC (B) of the rats in the 2 groups was observed by immunofluorescence, and the number of the synaptophysin positive cells (C) andIAvalues of synaptophysin (D) were determined. The scale bar=20 μm. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3免疫荧光实验检测2组大鼠在海马CA1区和PFC突触小泡蛋白的表达、突触小泡蛋白阳性细胞计数和突触小泡蛋白平均积分吸光度的比较

但是有没有其他蛋白质也参与了PTSD大鼠学习记忆能力的减退呢？突触小泡蛋白是突触前膜囊泡上的一种膜蛋白，是突触囊泡中含量最为丰富的蛋白之一，它担负着神经递质的包装、储存、调节及释放。大量研究表明，突触小泡蛋白表达的增加能够增强大鼠的空间辨别性学习记忆能力[8-9]。在本实验中，通过免疫组化、Western blot和免疫荧光实验检测了PTSD大鼠海马和PFC突触小泡蛋白的表达，结果表明，PTSD大鼠均较对照组显著减少，这可能也是导致其学习记忆能力减退的原因之一。

PFC在学习记忆等认知行为中也具有非常重要的作用[10-11]，但以往关于PTSD发病机制的研究在额叶皮层上相对较少。在本实验中，PTSD模型大鼠PFC突触小泡蛋白的表达较正常大鼠显著减少，这与Campos等[12]和Carvalho-Netto等[13]的研究结果是一致的。研究表明，急性创伤性应激可导致大鼠脑内凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的表达明显增加[14-15]。这可能是创伤性应激障碍导致脑内促凋亡蛋白的表达增加，加速了神经元的凋亡，进而使学习记忆相关蛋白的表达减少，最终导致大鼠的空间认知能力减退。

也有研究表明，在海马CA1区和PFC之间有一个CA1-mPFC网络环路，此环路通过多巴胺递质系统调节应激性抑郁的认知功能障碍[16]。故可作如下推测：在PTSD的大鼠模型中，当大鼠接受创伤性刺激之后，激活脑内的5-HT递质系统，使海马神经元损伤甚至是凋亡及坏死，突触前膜突触小泡蛋白的合成及释放也减少，再通过海马与PFC之间的神经环路，进而导致PFC学习记忆相关蛋白突触小泡蛋白的表达减少，突触可塑性的功能减退，最终导致大鼠的空间记忆能力减退。但是创伤后应激所致认知行为障碍的具体机制，还有待做更加深入的研究。