SDF-1α/CXCR4轴通过诱导胰腺癌上皮-间充质转化促进肿瘤迁移和侵袭*

李若梦， 邹金茂， 李雅晴， 陈少杰， 练国达， 陈茵婷， 苏 红， 黄开红

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科， 广东省恶性肿瘤表观遗传和基因调控重点实验室， 广东 广州 510120)

胰腺癌发病隐匿，早期即可发生远处转移，且对放化疗均不敏感，因此临床预后极差，5年生存率仅为6%[1-2]。近年来，越来越多的证据表明肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)在胰腺癌的发生发展过程中发挥重要作用[3]。基质细胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor-1，SDF-1; 又称趋化因子CXCL12)作为胰腺癌微环境中一种重要的趋化因子，主要在肿瘤间充质细胞中表达，而肿瘤细胞则高表达其特异性受体CXCR4。SDF-1/CXCR4轴可激活多条下游信号通路，参与胰腺癌的发生发展过程，尤其是侵袭和转移[4]。本研究旨在探讨SDF-1/CXCR4轴对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。

材 料 和 方 法

1 细胞

人胰腺癌细胞株PANC-1和Capan-2购自ATCC, BxPc-3和SW1990购自中国科学院细胞库。

2 主要试剂和仪器

SDF-1α购自Peprotech；AMD3100购自Sigma-Aldrich；兔抗人E-cadherin单克隆抗体、兔抗人N-cadherin单克隆抗体、兔抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体、鼠抗人SNAIL单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology；兔抗人TWIST多克隆抗体购自Abcam；高糖DMEM培养液购自Gibco；胎牛血清购自HyClone；TRIzol购自TaKaRa；基质胶和Transwell小室(8 μm孔径，聚碳酸酯膜)购自Corning；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海爱必信公司；HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)购自Merck Millipore；MTS试剂购自Promega；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，见表1。LightCycler 96 Real-Time PCR System(Roche)；G:BOX XT4智能成像系统(Syngene)；Eclipse 80i正置成像显微镜 (Nikon)。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1细胞培养 人胰腺癌细胞株PANC-1、BxPc-3、SW1990和Capan-2均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液、恒温37 ℃、5%CO2培养箱中，培养瓶中的细胞贴壁生长至80%～90%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。

3.2SDF-1α及AMD3100处理PANC-1细胞实验分组 将细胞接种于12孔板中，每孔加入1 mL完全培养液，含1.5×105个细胞。待细胞贴壁生长至约80%融合时，去掉培养液，用PBS洗2遍后，每孔加入1 mL无血清培养液饥饿处理细胞12 h。12 h后，去掉培养液。为检测SDF-1α处理不同时间对细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志物表达的影响，各组分别加入1 mL含100 μg/L SDF-1α无血清培养液处理细胞12 h、24 h、48 h和72 h；为检测不同浓度SDF-1α对细胞EMT相关标志物表达的影响，参考相关文献的浓度分组[5]，我们设置了50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L 3个SDF-1α浓度梯度组，即各组分别加入1 mL含50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L SDF-1α无血清培养液处理细胞48 h；为检测激活或阻断CXCR4对细胞EMT相关标志物表达的影响，我们设置了对照组、SDF-1处理组、SDF-1+AMD3100处理组和AMD3100处理组，对照组仅加入1 mL无血清培养液，SDF-1处理组加入1 mL含100 μg/L SDF-1α的无血清培养液，SDF-1+AMD3100处理组先加入1 mL含1 mg/L AMD3100的无血清培养液于培养箱孵育30 min后再加入100 μg/L SDF-1α，AMD3100处理组加入1 mL含1 mg/L AMD3100的无血清培养液,处理细胞48 h。

3.3RT-qPCR实验检测CXCR4的表达 按TRIzol说明书提取细胞总RNA,逆转录为CDNA。PCR反应在LightCycler 96 PCR仪上进行，每个样品同时设3个复孔。反应程序为：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，97 ℃ 1 s，40个循环；37 ℃ 30 s，1个循环。反应结束后，记录扩增曲线、熔解曲线及样本的循环阈值(Ct)，以β-actin为内参照校正各组mRNA的表达水平，采用2-ΔΔCt公式进行相对定量计算。实验独立重复3次。

3.4Western blot实验 细胞处理相应时间后，用PBS洗3次，加RIPA裂解15 min后提取细胞蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。20 μg等量蛋白上样，SDS-PAGE (70 mV恒压电泳至肉眼可见Marker分离后，换100 mV恒压电泳)，用0.45 μm PVDF膜200 mA恒流电转150 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Ⅰ抗稀释液(1∶1 000)4 ℃孵育过夜;TBST洗膜后，加入Ⅱ抗稀释液 (1∶5 000)室温孵育1 h。洗膜后用化学发光法(ECL)显像。

3.5Transwell迁移和侵袭实验 将Transwell小室置于24孔板中。侵袭实验前，在小室上室铺70 μL 1∶10稀释基质胶，置于培养箱过夜，待胶凝固后备用。迁移试验无需铺胶。将处于对数生长期的PANC-1细胞消化后用PBS洗1遍，用无血清培养液制成3×108/L的细胞悬液，分为对照组、SDF-1处理组、SDF-1+AMD3100处理组和AMD3100处理组：对照组和SDF-1处理组为仅含无血清培养液的细胞悬液，SDF-1+AMD3100处理组和AMD3100处理组的细胞悬液中先加入1 mg/L AMD3100于培养箱孵育30 min。向各组每个小室上室加入100 μL细胞悬液；对照组和AMD3100处理组下室加入500 μL含1%血清的培养液，SDF-1处理组和SDF-1+AMD3100处理组下室加入500 μL含1%血清和100 μg/L SDF-1α的培养液。将含小室的24孔板置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养16 h(迁移试验)和48 h(侵袭试验)。培养相应时间后，取出小室，用棉签轻轻擦去上室面细胞；纯甲醇室温固定下室面细胞15 min，PBS洗2次，棉签擦干上室面，室温放置5 min晾干；用结晶紫染色液染30 min，用双蒸水洗3次，室温充分风干；置于显微镜下观察并拍照，计算穿膜细胞数。实验独立重复3次。

3.6MTS实验 分为对照组、SDF-1处理组、SDF-1+AMD3100处理组和AMD3100处理组，对照组为仅用完全培养液重悬的细胞悬液，SDF-1处理组为含100 μg/L SDF-1α的细胞悬液，SDF-1+AMD3100处理组细胞悬液中先加入1 mg/L AMD3100于培养箱孵育30 min后再加入100 μg/L SDF-1α，AMD3100处理组为含1 mg/L AMD3100的细胞悬液。将PANC-1细胞悬液接种于96孔板，每孔加入200 μL培养液，含1×103个细胞。贴壁生长0 h(种板8 h)、24 h、48 h和72 h后去除培养液，每孔加入100 μL含有10% MTS溶液的DMEM培养液，37 ℃、 5%CO2培养箱中继续培养3 h。以空白组调零，酶标仪检测490 nm吸光度(A)值。实验独立重复3次。

4 统计学处理

用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同胰腺癌细胞株中CXCR4的mRNA表达情况

4种细胞株中均存在CXCR4 mRNA的表达，其中PANC-1细胞株中的表达水平最高，SW1990 细胞株中最低(P<0.05),见图1,因此，后续实验选择PANC-1细胞为研究对象。

Figure 1.The mRNA levels of CXCR4 in SW1990, BxPc-3, Capan-2 and PANC-1 cells were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsSW1990.

图1胰腺癌细胞株SW1990、BxPc-3、Capan-2和PANC-1中CXCR4mRNA表达水平

2 激活或阻断CXCR4对PANC-1细胞株迁移和侵袭功能的影响

与对照组相比，100 μg/L SDF-1α组可显著促进PANC-1细胞迁移和侵袭(P<0.05)；与SDF-1α组相比，预先用1 mg/L AMD3100处理PANC-1细胞后再加入100 μg/L SDF-1α，PANC-1细胞的迁移和侵袭能力显著降低(P<0.01),与对照组相比无明显差异，见图2、表2。

Figure 2.The migration and invasion PANC-1 cells treated with SDF-1α and AMD3100 (×100).

图2PANC-1细胞株经SDF-1α及AMD3100处理后迁移和侵袭能力的变化

表2 每视野迁移和侵袭细胞数

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSDF-1α group.

3 激活或阻断CXCR4对PANC-1细胞株活力的影响

PANC-1细胞经100 μg/L SDF-1α组处理72 h后，吸光度相比对照组增加(P<0.05)，即细胞活力增强；而预先用1 mg/L AMD3100处理PANC-1细胞后再加入100 μg/L SDF-1α以及仅使用1 mg/L AMD3100处理PANC-1细胞，与对照组相比，对PANC-1细胞活力无显著影响,见图3。

Figure 3.The MTS absorbance (A) value of PANC-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSDF-1α group.

图3PANC-1细胞株经SDF-1α及AMD3100处理后0h、24h、48h和72h的吸光度值

4 SDF-1α对PANC-1细胞株EMT相关标志物及EMT诱导转录因子表达的影响

PANC-1细胞株分别经100 μg/L SDF-1α处理12 h、24 h、48 h和72 h后，E-cadherin表达水平在48 h和72 h明显下降，N-cadherin、vimentin和SNAIL表达水平在12 h～48 h明显上升，而在72 h时稍升高，综合各EMT相关指标，24 h和48 h为SDF-1α最佳作用时间，见图4A。PANC-1细胞株分别经50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L SDF-1α处理后，E-cadherin表达水平随SDF-1α浓度升高而逐渐降低，vimentin、SNAIL和TWIST表达均升高(P<0.01)。综合各EMT相关指标，SDF-1α最佳作用浓度为100 μg/L,见图4B。

5 激活或阻断CXCR4对PANC-1细胞株EMT相关标志物及EMT诱导转录因子表达的影响

PANC-1细胞株经100 μg/L SDF-1α处理48 h后，E-cadherin表达水平相比对照组下降，vimentin、SNAIL和TWIST表达水平上升；而经100 μg/L SDF-1α+1 mg/L AMD3100和1 mg/L AMD3100分别处理48 h后，E-cadherin、vimentin、SNAIL和TWIST表达水平与对照组无明显差异，见图5。

讨 论

SDF-1又名CXCL12，属于CXC趋化因子家族，在多种组织细胞中广泛表达，对各种成熟和不成熟的造血细胞有显著趋化作用[5-6]。SDF-1主要有α和β 2种亚型，SDF-1α为优势表型，由骨髓基质细胞和内皮细胞分泌，几乎存在于所有器官中，促进组织破坏[7]。CXCR4是一种高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体，在许多正常组织中不表达或低表达，而在多种肿瘤包括胰腺癌中高表达[8]，通过与SDF-1α结合形成SDF-1/CXCR4轴，激活ERK1/2、JNK、Akt、p38 MAPK、GSK-3β等通路，参与肿瘤增殖、转移、血管生成等过程[7, 9-11]。

在本研究中，检测了4种胰腺癌细胞株中的CXCR4 mRNA表达水平，观察到低分化的胰腺癌细胞株PANC-1相比其它3种细胞株显著高表达CXCR4 mRNA，这与文献报道一致[5]，即CXCR4在胰腺癌细胞中的表达水平与细胞恶性程度有关，CXCR4可能参与胰腺癌细胞的转移。应用PANC-1进行生物学功能实验，证实SDF-1α能促进高表达CXCR4的PANC-1细胞迁移和侵袭，并增强其活力。研究认为SDF-1/CXCR4轴可激活MAPK、PI3K等通路，介导肿瘤细胞增殖[12]。在本研究中，我们发现SDF-1可促进PANC-1细胞间充质标志物表达上调，而上皮标志物表达下调，并伴随EMT诱导转录因子SNAIL和TWIST的改变。EMT是细胞形态由上皮表型向间质表型的转化，在此过程中，肿瘤细胞紧密黏附蛋白如E-cadherin蛋白表达下调，N-cadherin和vimentin等蛋白表达上调，导致细胞间紧密连接及细胞极性破坏，细胞间黏附减弱，细胞由多边形变为梭形，运动性增强，迁移和侵袭能力增强。EMT调控机制复杂，涉及表观修饰及转录调节，EMT诱导转录因子如SNAIL和TWIST是其中的关键分子，SNAIL主要抑制上皮标志物的表达，而TWIST能诱导间充质标志物的表达[13-16]。因而，我们的结果提示SDF-1/CXCR4轴能通过调控SNAIL和TWIST而促进PANC-1细胞发生EMT，进而增强其迁移和侵袭能力。更为重要的是，加入AMD3100后，这种促进作用可被阻断。AMD3100是一种CXCR4的高度特异性非肽类拮抗剂，可与CXCR4结合而阻断SDF-1/CXCR4轴[17]。近年来已有针对该靶点的治疗方案在研究中，包括化疗药物联合CXCR4拮抗剂[18]、CXCR4抗体[19-20]和AMD3100纳米微粒[20]等。

Figure 4.The expression levels of EMT-related markers and EMT-inducing transcription factors. A: PANC-1 cells were treated with 100 μg/L SDF-1α for different hours; B: PANC-1 cells were treated with different concentrations of SDF-1α for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h or 0 μg/L.

图4PANC-1细胞株经SDF-1α处理后EMT相关标志物及EMT诱导转录因子的表达

Figure 5.The expression levels of EMT-related markers and EMT-inducing transcription factors in PANC-1 cells treated with SDF-1α and AMD3100 for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsSDF-1α group.

图5PANC-1细胞株经SDF-1α及AMD3100处理后EMT相关标志物及EMT诱导转录因子的表达

综上所述，SDF-1α/CXCR4轴在胰腺癌侵袭与转移中发挥了一定作用，有望成为胰腺癌治疗的有效靶点。