H2S通过抑制TLR4/MyD88/PI3K信号通路减轻尿源性脓毒血症诱导的急性肾损伤*

许武军， 谢娟娟， 陈 仙

(南华大学附属第二医院泌尿外科， 湖南 衡阳 421000)

尿源性脓毒血症(urosepsis)是由泌尿生殖系统感染引起的全身性恶性炎症反应综合征，约占脓毒血症的30%[1]。近年来，随着医疗水平的不断提高，抗感染治疗以及器官功能支持疗法获得快速发展，但是脓毒血症的死亡率仍高达30%～70%[2]。肾脏是尿源性脓毒血症中最易受损的脏器之一，急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒血症常见的重症并发症，脓毒血症诱导的AKI死亡率可达75%左右[3]。研究证实硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)作为继NO和CO之后公认的第3种气体信号分子，具有调节中枢神经的作用[4]。秦文瀚等[5]研究发现外源性H2S能够显著降低内毒素脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤；舒维等[6]研究证实H2S供体NaHS可以通过调节炎症介质的释放减轻大鼠急性肺损伤。不仅如此，H2S还可以通过调节感染性免疫应答反应减轻脓毒血症引发的急性肺损伤[7-8]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)可以通过激活下游髓样分化因子88(myeloid differentiation factor-88，MyD88)依赖的信号通路，刺激炎症因子的合成以及释放。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是细胞内重要的调控蛋白，参与细胞的生长、分化、增殖和凋亡。TLR4通路的激活可以促进PI3K下游蛋白Akt的磷酸化，从而激活核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)，最终诱导炎症反应。本研究通过使用大肠杆菌建立兔上尿路感染所致的脓毒血症模型，探究TLR4/MyD88/PI3K通路在H2S保护尿源性脓毒性肾损伤中的作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

40只雄性新西兰白兔，体重(2.0±0.2)kg,购自南华大学实验动物学部，许可证号为SYXK(湘)2015-0001。实验开始前，实验动物先在动物室适应性喂养2周，温度(23±2)℃。大肠杆菌(ATCC 25922)由南华大学附二医院微生物室提供。

2 主要试剂

NaHS购自Sigma；抗TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt抗体购自Abcam；白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒购自Bio-swamp；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)、肾损伤分子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)和血降钙素原(procalcitonin，PCT)ELISA试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司；TLR4通路抑制剂TAK-242购自MedchemExpress；BCA试剂盒购自碧云天生物公司。

3 主要方法

3.1尿源性脓毒血症动物模型的建立 根据随机数字表法将40只新西兰白兔随机分为正常对照(control)组、假手术(sham)组、模型(sepsis)组、NaHS处理(NaHS)组及NaHS联合TAK-242处理(NaSH+TAK-242)组，每组8只。对照组8只白兔给予正常饲料和水喂养，不做处理。造模前腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉动物，假手术组8只白兔麻醉后左下腹腹直肌旁切口打开腹腔分离出左输尿管中段，肠管复位后关闭并缝合切口；24只白兔分离并结扎左侧输尿管中段，将1×1011/L的大肠杆菌悬液注入输尿管管腔内，注射剂量0.5 mL/kg。 NaHS处理组在造模后经耳缘静脉注射浓度为50 mmol/L的NaHS，注射剂量为 8.4 μmol/kg，TAK-242组术后耳缘静脉注射0.5 mg/kg TAK-242。所有白兔术后给予正常颗粒饲料和水喂养。术后72 h将所有白兔安乐死，动脉取血，取适量肾组织固定于4%多聚甲醛中用于组织病理学检测，另取适量肾组织于EP管中保存于-80 ℃备用。

3.2肾组织的HE染色 取适量肾脏组织使用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋制作病理切片。将石蜡切片经脱蜡、苏木精染色、分化以及蓝化后伊红染色、洗涤脱水以及透明后封片。使用光学显微镜观察组织变化情况并摄片。

3.3血液指标的检测 静脉取血5 mL，3 000 r/min，离心10 min，取上清。使用全自动生化分析仪检测血清肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。使用ELISA法检测血清中NGAL、KIM-1、PCT以及炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

3.4Western blot检测蛋白水平 取兔肾脏组织50 mg于2.0 mL EP管中，加入1 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，每管加入2粒玻璃珠，均浆器匀浆5 min后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取上清使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。每组取30 μg蛋白进行SDS-PAGE，检测TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平。以GAPDH作为内参照，使用BanScan 5.0软件进行灰度值分析。

4 统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行所有数据的统计学分析。实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，各组之间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 NaHS对脓毒血症兔肾脏组织病理学影响

HE染色结果显示，control组和sham组的兔肾脏组织结构完整，无充血以及炎性细胞浸润;sepsis组兔肾小球变形，肾曲小管浊肿变形坏死，肾小管管腔变大，肾间质充血，大量炎性细胞浸润;NaHS和NaHS联合TAK-242处理后上述变化显著减轻，见图1。

Figure 1.The histopathological changes of rabbit kidneys were observed by HE staining. Arrow: renal interstitial hyperemia and edema, and inflammatory cell infiltration; oval: necrosis and detachment of renal tubular epithelial cells.

图1HE染色观察兔肾脏组织病理变化

2 NaHS处理显著改善脓毒血症兔血清SCr和BUN水平

Sepsis组兔血清中SCr和BUN水平显著高于对照组(P<0.05)，但NaHS处理后兔血清中SCr和BUN水平显著降低(P<0.05)，且TAK-242联合NaHS处理后脓毒血症兔血清中BUN水平显著低于NaHS组(P<0.05),见图2。

3 NaHS处理显著改善脓毒血症兔血清NGAL、KIM-1和PCT水平

Sepsis组兔血清中NGAL、KIM-1和PCT水平与对照组比显著升高(P<0.05)；与sepsis组相比，NaHS处理后兔血清NGAL、KIM-1和PCT的水平显著降低(P<0.05)；与NaHS组相比，NaHS联合TAK-242处理组兔血清中NGAL和PCT进一步降低(P<0.05)，见图3。

4 NaHS处理显著改善脓毒血症兔血清炎症因子水平

脓毒血症模型组兔血清中的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著高于对照组(P<0.05)；NaHS处理72 h后能显著降低脓毒血症兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，说明NaHS能在一定程度上缓解脓毒血症诱发的炎症反应(P<0.05)；使用TAK-242抑制TLR4通路以后，血清炎症因子IL-6和TNF-α水平进一步降低(P<0.05)，见图4。

Figure 2.The levels of BUN and SCr in the rabbits of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

图2各组兔BUN和SCr水平的变化

Figure 3.The levels of NGAL, KIM-1 and PCT in the rabbit se-rum of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

图3各组兔血清中NGAL、KIM-1和PCT含量的变化

5 TLR4/MyD88/PI3K通路参与NaHS减轻脓毒血症诱导的急性肾损伤的作用

脓毒血症兔肾组织中TLR4和MyD88蛋白水平显著上升(P<0.05)，PI3K/Akt通路激活，p-PI3K和p-Akt的蛋白水平显著上升(P<0.05)；NaHS处理后TLR4/MyD88/PI3K通路激活受到显著抑制，说明NaHS可以通过抑制TLR4/MyD88/PI3K信号通路激活减轻脓毒血症型肾损伤,见图5。

Figure 4.The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the rabbit serum of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

图4各组兔血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量的变化

讨 论

脓毒血症的致病机制是诱发全身性恶性炎症反应，急性肾损伤是其常见的并发症，若不及时采取有效的治疗措施极易诱发多器官功能衰竭。炎症介质的释放在脓毒血症诱导的机体损伤中起关键作用，与病情发展的严重程度以及预后明显相关[9]。在脓毒血症急性肾损伤发展过程中，炎症反应介导血管内皮损伤和肾小管功能紊乱，提示抑制机体炎症免疫反应可能为有效治疗脓毒血症急性肾损伤提供新的治疗策略。

本研究中兔尿源性脓毒血症造模72 h后血清SCr和BUN浓度显著升高，说明脓毒血症造模成功；且脓毒血症相关AKI标志物NGAL、KIM-1和PCT含量也显著升高，说明发生了急性肾功能损伤。此外，免疫调节因子IL-1β、IL-6和TNF-α在sepsis模型动物血液中的水平也显著提高，说明炎症反应在尿源性脓毒血症肾损伤中发挥重要作用。TLR4/MyD88通路在调节炎症因子释放过程中发挥重要作用。TLR4作为炎症上游因子可以通过识别细胞表面抗原，发挥信号转导功能以及介导炎症反应[10];MyD88作为TLR4的下游信号分子，可以通过与TLR4结合调控炎症因子的合成与释放，参与炎症反应[11];PI3K作为细胞内重要的调节因子，在细胞的生长和凋亡中发挥重要作用;TLR4可以通过作用于p85亚基激活PI3K/Akt通路。本研究通过Western blot技术检测TLR4、MyD88以及PI3K/Akt通路蛋白的表达情况，结果发现在尿源性脓毒血症兔肾组织中TLR4和MyD88蛋白表达显著升高，且PI3K/Akt信号通路激活，表明尿源性脓毒血症AKI与TLR4/MyD88/PI3K信号通路相关。

Figure 5. The protein levels of TLR4, MyD88, PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt in the rabbit kidney tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssepsis group;▲P<0.05vsNaHS group.

图5兔肾组织中TLR4、MyD88、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的变化

研究表明肾组织可以通过胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶作用于含硫氨基酸产生内源性H2S，发挥肾功能调节作用[12]。越来越多的研究证实H2S在脓毒血症肾损伤中发挥重要保护作用。我们的前期研究也证实H2S可以通过抑制NF-κB信号通路阻断炎症因子的表达，减轻尿源性脓毒血症肾损伤[13]。本研究结果也发现NaHS处理后，sepsis兔血液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及Scr、BUN水平显著降低，肾损伤相关标志物NGAL、KIM-1和PCT也显著降低，说明NaHS处理能够显著缓解尿源性脓毒血症性急性肾损伤。TLR4/MyD88信号通路作为NF-κB的上游调节因子可以调控NF-κB的表达。为进一步探究NaHS在保护尿源性脓毒血症性肾损伤中的作用机制，我们检测了肾组织中TLR4/MyD88/PI3K信号通路，以及使用NaHS联合TLR4抑制剂TAK-242处理，结果发现NaHS显著抑制肾组织中TLR4/MyD88/PI3K信号通路的激活，且使用联合TLR4抑制剂处理后对损伤肾脏的保护作用加强。陈克研等[14]研究也证实抑制TLR4信号通路，可以通过抑制炎症反应发挥对肾脏的保护作用。