miRNA-33对Hcy干预RAW264.7巨噬细胞衍生的泡沫细胞表达ABCA1/ABCG1的影响*

代 佩， 高 奋， 高宏伟， 王 远， 冯高洁， 张秦风， 白 瑞， 秦卫伟， 李 虹， 宋晓苏

(山西医科大学第二医院心内科， 山西 太原 030001)

微小RNA(microRNA，miRNA)是由18～22个核苷酸组成的内源性非编码单链RNA，其在转录后水平通过与靶mRNA的3’或5’非翻译区(untranslated region,UTR)结合调控基因表达，主要与3’-UTR中特定的碱基顺序列结合，通过抑制转录或翻译调控机体病理生理过程[1]。业内已证实miRNA-20a、miRNA-27、miRNA-758、miRNA-164和miRNA-33等miRNA均可参与心血管疾病的调控[2]。2010年， Rayner等[3]发现miRNA-33可抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1， ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1， ABCG1)的表达，从而抑制胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport， RCT)，导致动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)。近年来国外已经在肝细胞、巨噬细胞和ApoE-/-小鼠证实过表达miRNA-33可抑制ABCA1和ABCG1的表达，降低胆固醇的流出率，血浆内可见高密度脂蛋白(high-density lipoprotein， HDL)水平降低；相反抑制miRNA-33的表达可增加ABCA1和ABCG1的表达，HDL浓度增高，说明其在动脉粥样硬化病变调控过程中具有重要意义[4-5]。

同型半胱氨酸(homocysteine， Hcy)是冠心病(coronary heart disease， CHD)的独立危险因子[6]。Hcy可以通过氧化应激、炎症反应、损伤内皮细胞、促进血栓形成、影响体内脂质代谢及抑制ABCA1和ABCG1降低胆固醇流出率等多种机制导致动脉粥样硬化发生[7]。李小红等[8]和Mi等[9]已经间接推测出低水平的Hcy可激活自噬，保护心肌细胞，而高水平的Hcy导致自噬过度激活而加重心肌细胞的损伤。ABCA1和ABCG1是胆固醇逆转运调控的关键分子，但是关于Hcy是否通过miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的表达降低胆固醇逆转运的效率，导致动脉粥样硬化发生，至今尚未有研究。

本实验旨在研究Hcy致AS过程中，是否通过miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的表达，从而降低胆固醇逆转运效率，同时进一步阐述了Hcy致动脉粥样硬化的机制。

材 料 和 方 法

1 材料和主要试剂

RAW264.7细胞株(上海中科院细胞中心)；Hcy和RNA 提取试剂TRIzol(索莱宝公司)；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)(北京欣和佳源公司)；DMEM 培养基(博士德)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；Opti-MEM 专用培养基 (Gibco)； LipofectamineTM2000 转染试剂(Invitrogen)； miRNA-33 mimics/inhibitor (上海吉玛制药技术有限公司)；逆转录试剂盒(TaKaRa)；[3H]标记的胆固醇(American Life Science)。

2 主要仪器

CO2培养箱(Thermo)；PCR仪和酶标仪(Bio-Rad)；超净工作台 (苏州市汉达工业自动化有限公司)；相差倒置显微镜(Nikon TS100)；FJ22107P液体闪烁计数仪 (国营二六二厂)；低温离心机(Eppendorf)；恒温水浴箱 HS-4(成都仪器厂)；电子天平(Sartorius)；酸碱度仪 PB-10(Sartorius)。

3 实验方法

3.1RAW264.7细胞的复苏、培养和传代 从液氮罐中取出冻存的RAW264.7巨噬细胞，置于25 cm2的培养瓶中，用DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%青、链霉素钠)，在温度37 ℃、5% CO2的条件下培养，在细胞生长良好的状态下，细胞覆盖培养瓶的80%～90%时，用含0.25%的胰蛋白酶消化并按(1∶4)进行传代。

3.2RAW264.7源性泡沫细胞的诱导 待细胞传2～3代后，取生长较好的对数期细胞经消化、离心后，用2 mL DMEM培养基稀释，待细胞吹打均匀后取10 μL滴于细胞计数板进行细胞计数，按1.8×109/L细胞进行种板，24 h观察细胞，待细胞密度接近70%～80%时，每孔加入50 mg/L ox-LDL诱导，同时更换为DMEM培养基(含4%胎牛血清和1%青、链霉素)培养24 h后进行后续实验。

3.3细胞转染及实验分组 RAW264.7源性泡沫细胞诱导成功以后，根据LipofectamineTM2000 转染说明书进行转染，细胞再转染前1～2 h需换成Opti-MEM无血清培养基培养6～8 h，后每组均给予5 mmol/L的Hcy干预(包括空白对照组)，24 h后收集细胞进行实验。实验共分为5组，分别为空白对照组、miRNA-33 mimics组、miRNA-33 mimics-NC组、miRNA-33 inhibitor组和miRNA-33 inhibitor-NC组。

3.4油红O染色 使用前将油红O液体与蒸馏水以3∶2比例配制，静置10 min，吸取6孔板的培养液，用遇冷的PBS清洗3次；4%中性甲醛固定10 min后，再用PBS清洗3次；每孔加入约1.5 mL已配置好的油红O染色液，30 min后用PBS清洗3次，于相差荧光倒置显微镜下观察。

3.5Western blot检测ABCA1和ABCG1的蛋白表达 轻轻吸去细胞培养液，用预冷PBS 清洗 3 次细胞；以一定比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂(100∶1)，用刮刀刮下细胞，静置20～30 min后将裂解的蛋白装入有标记EP管经超声波粉碎机粉碎，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，将上层液体(即收集的蛋白)移入另一EP管，直接用于实验或-80 ℃保存。用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，根据凝胶配置试剂盒说明书进行配胶，经SDS-PAGE分离、转膜将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%牛奶TBST封闭2 h 后孵育 I 抗，4 ℃摇床过夜后，TBST洗膜3次，每次5 min,室温摇床孵育 II 抗2 h，再次洗膜后进行曝光(超敏ECL法)。

3.6RT-qPCR检测miRNA33的转染效率及ABCA1和ABCG1的mRNA表达 待细胞干预后，吸取培养液，PBS清洗细胞3次，用TRIzol试剂提取RNA，用紫外分光光度计来测定RNA的浓度以及纯度，使RNA的A260/A280保持在1.9～2.1之间；按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书合成cDNA；PCR扩增反应条件为95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～60 s，循环40次进行PCR反应，以HS-ACTB作为内参照。运用2-ΔΔCt进行分析。

3.7液体闪烁计数法测胆固醇流出率 将RAW264.7源性泡沫细胞用[3H]标记的胆固醇负荷培养24 h，用PBS液清洗2次，换用新的培养液(含10%胎牛血清和1%青、链霉素钠)按上述实验条件培养细胞，干预后用PBS液洗涤细胞，后培养于含25 mg/L 载脂蛋白A-I (apolipoprotein A-I, ApoA-I)的新鲜培养基6 h，经闪烁液裂解细胞后，用闪烁计数法检测培养液和细胞的[3H]标记的胆固醇。胆固醇流出率(%)=培养液闪烁计数/(培养液闪烁计数+细胞闪烁计数)×100% (闪烁计数的单位为min-1)。

3.8高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量 药物干预后按上述方法清洗RAW264.7源性泡沫细胞，加入一定量的0.5% NaCl溶液，超声波粉碎10 min，将裂解的液体分成2份，分别用于总胆固醇和游离胆固醇的提取。取合适的胆固醇标准品溶解于流动相中，置于10 mL玻璃瓶中，等倍比稀释5个不同浓度梯度于EP管中，分别是0、78.125、156.25、312.5、625和1 250 mg/L，将上述标准品溶液分别注入高效液相色谱仪，进样量为10 μL，以胆固醇的质量浓度为横坐标X轴，其峰面积为纵坐标Y轴，绘制标准曲线。采用Waters反向C18柱，流动相为异丙醇+乙腈(两者体积1∶1)，流速 1 mL/min，柱温 40 ℃，将各实验组所得的样品溶液按上述色谱条件，进样20 μL，记录胆固醇的峰面积。计算总胆固醇量(total cholesterol，TC)和游离胆固醇(free cholesterol，FC)量，总胆固醇量减去游离胆固醇量为胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)的量。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 油红O染色观察细胞内脂滴含量

在相差倒置荧光显微镜20倍镜下观察诱导成功后的泡沫细胞，细胞被染成橘黄色，见图1A；同时在镜下观察到miRNA-33 mimics转染后的细胞脂滴含量比miRNA-33 inhibitor组的脂滴含量多，见图1B。

Figure 1.Oil red O staining to observe intracellular lipid droplets (×200).A: observation of successfully induced RAW264.7 foam cells; B: observation of intracellular lipid droplets after transfection of miRNA-33 mimics and miRNA-33 inhibitor.

图1油红O染色观察细胞内脂滴含量

2 miRNA-33 mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1和ABCG1表达的影响

将miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor转染至RAW264.7源性泡沫细胞内，经同一浓度Hcy干预后，用RT-qPCR及Western blot 检测ABCA1和ABCG1的表达,结果发现与空白对照组相比，miRNA-33 mimics组ABCA1和ABCG1的mRNA及蛋白表达量较低，而miRNA-33 inhibitor组ABCA1和ABCG1的mRNA及蛋白表达量较高(P<0.05)，见图2～4。

Figure 2.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on the protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

图2miRNA-33mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达的影响

3 miRNA-33 mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞内胆固醇流出率的影响

将miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor转染至RAW264.7源性泡沫细胞内，经同一浓度Hcy干预后，用液体闪烁计数法测各组细胞的胆固醇流出率，结果显示miRNA-33 mimics组细胞的胆固醇流出率降低，miRNA-33 inhibitor组细胞的胆固醇流出率增加(P<0.05)，见图5。

Figure 3.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on the protein expression of ABCG1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

图3miRNA-33mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞ABCG1蛋白表达

4 miRNA-33 mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

将miRNA-33 mimics或miRNA-33 inhibitor转染至RAW264.7源性泡沫细胞内，经同一浓度Hcy干预后，高效液相色谱检测细胞内的胆固醇含量，结果示miRNA-33 mimics组细胞的胆固醇含量较高，miRNA-33 inhibitor组细胞的胆固醇含量低下(P<0.05)，见表1。

讨 论

随着人们生活方式的改变，冠心病的发生率趋向于年轻化，且已成为导致患者死亡的主要原因之一[10]。动脉粥样硬化是其发生的病理机制，而脂质代谢紊乱是其导致AS发生的病理基础，泡沫细胞的形成是AS的起始标志之一[11]。现在关于冠心病的治疗及预防，尤其近年来在分子水平的研究仍是大家研究的重点。

Figure 4.The effect of miRNA-33 mimics/inhibitor on the mRNA expression of ABCA1 and ABCG1 in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

图4miRNA-33mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1和ABCG1mRNA表达的影响

Figure 5.The effect of miRNA-33 mimics/inhibitor on the cholesterol efflux rate in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells determined by liquid scintillation counting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

图5液体闪烁计数仪检测细胞胆固醇流出率

表1miRNA-33mimics/inhibitor对RAW264.7源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

Table 1.The effects of miRNA-33 mimics/inhibitor on cholesterol content in the RAW264.7 macrophage-derived foam cells (Mean±SD.n=3)

GroupTC (mg/dL)FC (mg/dL)CE (mg/dL)CE/TC (%)Blank control396±10150±4246±662miRNA-33 mimics600±8∗△254±10∗△346±6∗△57miRNA-33 mimics-NC403±12146±4257±1263miRNA-33 inhibitor286±24∗#95±4∗#191±13∗#66miRNA-33 inhibitor-NC408±7147±3261±963

TC: total cholesterol; FC: free cholesterol; CE: cholesteryl ester.*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsmiRNA-33 mimics-NC group;#P<0.05vsmiRNA-33 inhibitor-NC group.

同型半胱氨酸是甲硫氨酸循环代谢的中间产物，研究证明其是冠心病的独立危险因素，并且血Hcy水平也是预测冠心病死亡率的指标之一[12]。临床上将由各种原因导致的血浆同型半胱氨酸超过15 μmol/L称为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)[13]。 Hcy可通过以下机制导致AS：增强基质金属蛋白酶的表达及促进血管平滑肌增殖；促进氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和血管内皮功能障碍；破坏体内凝血与纤溶间的平衡关系，导致血小板聚集和血液凝固性增高；通过引起胆固醇调节障碍及抑制ABCA1和ABCG1表达降低胆固醇逆转运效率等多种机制导致AS[14-15]。我们在实验中发现Hcy可以通过抑制ABCA1和ABCG1的表达降低RCT，导致AS。

胆固醇逆转运是以HDL为载体排出体内多余胆固醇的主要途径之一[16]。ABCA1和ABCG1作为ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)家族的成员，均包含由180个氨基酸组成的标志性ATP 结合域，即核酸结合域(nucleotide-binding domain，NBD)，均以ATP作为能量供应体对体内各种物质进行转运，同时也是胆固醇逆转运的重要调控靶点，ABCA1和ABCG1在RCT过程中主要负责胆固醇的流出[17]。

miRNAs是高度保守的单链非编码RNA，在转录及转录后水平参与机体病理、生理及脂质代谢调控[18]。2010年，Rayner等[3]和Horie 等[19]发现miRNA-33与宿主基因固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein，SREBP)共转录，在转录后水平参与调控抑制RCT关键酶ABCA1和ABCG1的表达，参与胆固醇逆转运代谢。miRNA-33包括miRNA-33a和miRNA-33b 2个亚基，其位于内含子miRNA的SREBP处的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子的主要功能是调节糖、脂代谢[20-21]。我们在本研究中发现，给予同一浓度Hcy干预后，miRNA-33 mimics组的ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达量及胆固醇流出率相比miRNA-33 inhibitor组均是下降的，且miRNA-33 mimics组细胞内的胆固醇含量相比miRNA-33 inhibitor组是增加的，而空白对照组和miRNA-33 mimics-NC组和miRNA-33 inhibitor-NC组3组相比较，所检测指标均无统计学显著性，说明miRNA-33 mimics可以通过抑制ABCA1和ABCG1的表达抑制RCT，导致AS。因此初步得出结论Hcy可以通过诱导miRNA-33抑制ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达抑制RCT，导致AS。

本研究是从细胞水平探讨同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的新机制，存在一定缺陷，接下来我们将继续从动物水平进一步验证。