亮氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖及氨基酸转运的影响

施 魁，唐燕妮，刘 炀，管武太，陈 芳，邓跃林

（华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510642）

胎盘作为哺乳动物妊娠期母体与胎儿之间物质交换的重要器官，对胎儿的宫内发育具有非常重要的作用[1]。胎盘滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成部分，位于胎盘屏障的最外层，其直接接触母体血液，在妊娠识别、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发育、代谢废物的运输以及维持妊娠等各个方面都起到非常重要的作用[2]。

氨基酸在动物体内不仅是合成蛋白质的重要成分，也是合成神经递质和核苷酸等非蛋白物质的重要前体物质[3]。在宫内发育过程中，胎儿通过胎盘得到母体血液中的氨基酸对其生长发育十分重要。氨基酸的跨膜转运是主动运输，这一过程需在氨基酸转运载体的介导下才可实现。因此，氨基酸转运载体的功能对维持胎儿在子宫内的存活以及正常生长发育起着至关重要的作用。Cramer等[4]研究表明，在A系列氨基酸转运系统的转运活性降低的情况下，胎儿会发生宫内发育迟缓（IUGR）现象。Dicke等[5]研究发现，已经发生IUGR的母猪胎盘中A系列氨基酸转运载体的表达显著降低。Kavitha等[6]研究发现，IUGR胎儿的胎盘中氨基酸转运载体LAT1、LAT2和SNAT2的蛋白表达量均显著降低。

本实验室前期研究发现，母猪妊娠后期在基础日粮中添加 0.4%～0.8%亮氨酸（Leu）能通过增加胎猪体蛋白质沉积从而促进胎儿宫内发育，且显著提高了新生仔猪背最长肌、小肠和胎盘氨基酸转运载体的表达[7]。因此，本研究旨在利用细胞模型进一步探究Leu对猪胎盘滋养层细胞（pTr）增殖、细胞氨基酸转运载体以及mTOR信号通路的影响，以期对妊娠母猪日粮中Leu的使用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞完全培养基 DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）：每500 mL中添加0.8%双抗（美国Gibco公司）、0.5% ITS、10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）。

1.2 亮氨酸母液的配制 Leu（美国Sigma公司）为无菌的白色粉末状结晶，准确称取0.131 g Leu，溶于40 mL含1% FBS的完全培养基中，经0.22 μm滤膜过滤除菌，终浓度为25 mmol/L，于-20℃保存备用；后用含1%FBS的DMEM/F12培养基稀释备用。

1.3 引物设计合成 参考NCBI中GenBank公布的基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计合成，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

1.4 RNA的提取及实时荧光定量PCR 采用传统法用Trizol裂解液（美国Invitrogen公司）提取猪胎盘滋养层细胞系（pTr由德州农工大学伍国耀教授馈赠）中的总RNA，并用核酸/蛋白定量仪来检测其浓度，再参照DNase I（RNase Free，1 000 Units）、DNA Marker（DL 2000）、TaKaRa反转录试剂盒进行合成cDNA。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL：cDNA 1 μL，目的基因上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），SYBY Green Real time PCR Master Mix（日本TOYOBO（上海）公司） 10 μL，DEPC水（美国 Sigma公司）8 μL。PCR反应条件：预变性（95℃ 60 s）；扩增（95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 40 s），38个循环；熔解（95℃ 60 s；60℃ 30 s；95℃ 30 s；60℃ 15 s）。

1.5 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件进行Duncan´s多重比较和方差分析，结果均以平均值±标准误表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 Leu对pTr细胞周期相关基因CDK4表达的影响如图1所示，不同浓度Leu处理pTr细胞24 h后，各试验组CDK4的mRNA相对表达量与对照组无显著差异（P＞0.05）；处理48 h后，10 mmol/L试验组CDK4的mRNA相对表达量较对照组显著降低（P＜0.05）。

表1 相关目的基因及内参基因β-actin引物参数

图1 不同浓度Leu处理pTr细胞对其CDK4 mRNA相对表达量的影响

2.2 Leu对pTr细胞凋亡相关基因Caspase-8表达的影响 如图2所示，不同浓度Leu处理pTr细胞24 h和48 h后，各试验组Caspase-8的mRNA相对表达量与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

图2 不同浓度Leu处理pTr细胞对其Caspase-8 mRNA相对表达量的影响

2.3 Leu对pTr细胞氨基酸转运载体表达的影响 如图3所示，Leu处理pTr细胞24 h后，1 mmol/L试验组SNAT1的mRNA相对表达量较对照组极显著降低（P＜0.01），但10 mmol/L试验组和对照组之间差异不显著（P＞0.05），此外10 mmol/L试验组SNAT1的mRNA相对表达量显著高于1 mmol/L试验组（P＜0.05）；各试验组SNAT2、LAT1、4F2hc和rBAT的mRNA相对表达量与对照组无显著差异（P＞0.05）。

如图4所示，Leu处理pTr细胞48 h后，所有试验组的氨基酸转运载体SNAT1、SNAT2、LAT1、4F2hc和rBAT的mRNA相对表达量随着Leu浓度增加均呈不同程度降低。与对照组相比，1 mmol/L试验组LAT1 mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05）；10 mmol/L试验组SNAT1、SNAT2、LAT1 mRNA相对表达量较对照组极显著降低（P＜0.01），rBAT mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05），4F2hc基因无显著差异（P＞0.05）。

2.4 Leu对pTr细胞mTOR信号通路表达的影响 如图5所示，Leu处理pTr细胞24 h后，1 mmol/L试验组4E-BP1和eIF4G的mRNA相对表达量显著低于对 照 组（P＜0.05）；10 mmol/L试 验 组mTORC1的mRNA相对表达量极显著高于对照组和1 mmol/L试验 组（P＜0.01）。但 1 mmol/L和 10 mmol/L试验组S6K1、eIF4G、PKB的mRNA相对表达量与对照组差异均不显著（P＞0.05）。

图3 不同浓度Leu处理pTr细胞24 h对其氨基酸转运载体mRNA相对表达量的影响

图4 不同浓度Leu处理pTr细胞48 h对其氨基酸转运载体mRNA相对表达量的影响

图5 不同浓度Leu处理pTr细胞24 h对其mTOR信号通路mRNA相对表达量的影响

如图6所示，Leu处理pTr细胞48 h后，1 mmol/L试验组4E-BP1 mRNA相对表达量显著低于对照组（P＜0.05），10 mmol/L试 验 组4E-BP1 mRNA相 对表达量极显著低于对照组（P＜0.01）。10 mmol/L试验组mTORC1 mRNA相对表达量显著高于对照组和1 mmol/L试 验 组（P＜0.05）。 各 组S6K1、eIF4G和PKB mRNA相对表达量差异均不显著（P＞0.05）。

图6 不同浓度Leu处理pTr细胞48 h对mTOR信号通路mRNA相对表达量的影响

3 讨 论

3.1 Leu对pTr细胞增殖的影响 细胞周期性分裂是一个复杂的过程，其中周期蛋白依赖性激酶（Cyclin Dependent Kinase，CDK）发挥着非常重要的作用，但其需要与特异性周期蛋白（Cyclin）结合才具有蛋白激酶的活性，其中CDK作为催化亚基，Cyclin作为调节亚基。细胞周期从G1期过渡到S期主要是通过CDK4与Cyclin D产生的特异性结合来促进的[8]。Takeuchi等[9]研究表明，高浓度Leu能够抑制C6大鼠Cyclin D1蛋白的表达，从而抑制神经胶质瘤细胞的生长。本次试验结果表明，0、1、10 mmol/L Leu处理pTr细胞24 h和48 h后，CDK4基因的mRNA相对表达量均呈不同程度降低，尤其是10 mmol/L组处理48 h出现显著降低的效果。这一结果提示了高浓度Leu可能会使细胞周期停滞在G0～G1期，减少其向S期的转变。

细胞凋亡即细胞在一定的生理或病理条件下主动死亡的过程，此过程由多种凋亡相关基因进行调控[10]。细胞凋亡需要在多种酶的参与下进行一系列的基因激活、表达及调控，在维持机体内环境稳态和正常生理代谢等方面具有重要意义[11-12]。半胱氨酸蛋白酶（Caspases）是参与真核细胞凋亡的重要蛋白之一[13]。Caspase被激活后会诱导细胞内相关底物的降解，从而引起细胞凋亡[13-14]。Wakshlag等[15]研究发现，高浓度Leu处理会促进犬肾细胞和骨肉瘤细胞凋亡，且处理细胞后Caspase-3和Caspase-2被激活，而Caspase-8未被激活，从而产生了Leu通过介导线粒体途径来调控细胞凋亡的猜测。本试验结果表明，不同Leu处理pTr细胞24 h和48 h后，Caspase-8基因的mRNA相对表达量与对照组差异均不显著。这与Wakshlag等[15]的研究结果一致，因此，可以推测高浓度Leu诱导细胞凋亡不是通过Caspase-8途径介导的。

3.2 Leu对 pTr细胞氨基酸转运载体表达的影响Wilson等[16]研究表明，对5日龄仔猪注射Leu后，提高了骨骼肌中氨基酸转运载体（如LAT1）的表达，导致新生体体重和肌肉质量的增加。本实验室前期研究发现，妊娠后期日粮添加0.4%～1.2%Leu 显著提高了胎盘、新生仔猪小肠以及背最长肌中氨基酸转运载体LAT1、SNAT1、SNAT2、4F2hc和rBAT的表达[17]。彭飞[18]的研究表明，SD大鼠母体能量摄入量对胎盘氨基酸转运载体SNAT1、SNAT2的mRNA相对表达量有上调作用，但差异不显著。Zhang等[19]用7.5 mmol/L的Leu对IPEC-J2细胞进行了处理，结果表明氨基酸转运载体ASCT2和4F2hc的mRNA表达量上升。而本试验结果表明，Leu处理pTr细胞，SNAT1、SNAT2、rBAT、LAT1以及4F2hc的mRNA的相对表达量在24 h和48 h后均下降。结果不同的原因可能是研究者所使用的培养基有差别，Zhang等[19]使用的是不含Leu的培养基，在Leu缺乏的情况下进行处理氨基酸转运载体表达量提高，而本试验使用的培养基含有能够维持细胞正常增殖的Leu，因此本试验添加的Leu 可能导致Leu 浓度过高，细胞内氨基酸失衡，从而抑制了细胞增值，并降低了细胞内氨基酸转运载体的表达。

3.3 Leu对pTr细胞mTOR信号通路的影响 近年来许多研究表明，mTOR 信号通路能影响到LAT1、4F2hc及氨基酸转运系统A的表达[20-21]。Luo等[22]在L6大鼠的肌肉细胞培养基中加入0.105 g/L Leu，发现LAT1、4F2hc和SNAT2的mRNA相对表达水平可以通过mTORC1依赖性ATF4信号通路进行调节。此外，mTOR信号通路也会受到氨基酸浓度的影响，氨基酸能够激活mTOR信号通路来调控细胞的生长代谢。Escobar等[23]研究表明，给新生仔猪添加Leu 可以通过增强信号传导刺激蛋白质合成，以促进mRNA的翻译。Yuan等[24]研究表明，当氨基酸缺乏时mTOR信号通路会被抑制，GCN信号通路则被激活。本研究中，使用Leu处理pTr细胞24 h后，10 mmol/L 试验组mTORC1的mRNA相对表达量极显著高于对照组，48 h后，差异降为显著，认为这可能与Leu在细胞内的分解代谢有关。细胞内支链氨基酸的分解代谢有多种酶参与，其中包括线粒体支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH），产生的代谢产物最终会进入到三羧酸循环中去。Wessels等[25]研究表明，高浓度Leu能增加BCKDH在组织中的活性，过量Leu会促使支链氨基酸的分解加强，从而机体内支链氨基酸浓度降低。因此推测，高浓度Leu可能会通过对pTr细胞中BCKDH活性的刺激，从而提升Leu的分解代谢，而随着时间的推后，细胞中Leu浓度开始下降，从而削弱了对mTOR信号通路的影响。此外，本试验结果显示，使用高浓度（10 mmol/L）Leu处理pTr细胞后，mTOR下游信号S6K1、4E-BP1和eIF4G的mRNA相对表达量均低于对照组，尤其是处理48 h后，4E-BP1的mRNA相对表达量极显著下降，这可能是高浓度Leu会激活mTOR上游信号通路，同时对其下游信号通路有抑制作用。

4 结 论

高浓度Leu（10 mmol/L）显著降低了增殖相关基因CDK4的mRNA表达，但对细胞凋亡相关基因Caspase-8的表达无显著影响；高浓度Leu（10 mmol/L）还可以通过mTOR信号通路降低pTr细胞氨基酸转运载体mRNA的表达。