辣木籽中总黄酮的提取工艺研究

1.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 西双版纳 666303；2.云南中医学院，云南 昆明 650500

辣木(Moringaoleifera) 又名洋椿树、鼓槌树，为辣木科( Morin gaceae) 辣木属(Morin ga Adans.) 植物，起源于印度西北部的喜马拉雅山南麓，是辣木属中可以食用且利用和研究最多、最有商业价值的品种。我国于20 世纪60 年代初开始在台湾、海南、广东、云南南部等广大热带、亚热带地区引种辣木。辣木为药食两用的植物，其树叶、花、果荚不仅含有钙、钾和氨基酸等营养物质，且在印度和非洲国家常用于退热、消炎、降压、强心和抗菌等[1]。目前，国内外学者主要集中于辣木营养学方面的研究[2-3]，辣木的药用保健功能日益受到人们的重视[4]。

辣木籽作为纯天然绿色食品，营养物质含量非常丰富，食用辣木籽可预防疾病、延缓衰老、改善睡眠、增强免疫力和记忆力[5]。经初步分析，辣木籽中含有黄酮类化合物[6]。黄酮类化合物的生理活性比较广泛，具有清除自由基、抗氧化、抗癌、防癌、治疗心血管病、降血糖等作用。近年来对辣木的开发已成热点，但从辣木籽中提取黄酮类化合物的研究鲜有报道[7]。本文以辣木籽总黄酮转移率为指标，采用正交试验方法分别考察微波提取法、回流提取法、超声提取法中的各种影响因素，旨在提高辣木籽中总黄酮的提取率，并通过对比产生最佳的提取工艺，为辣木籽的进一步开发利用提供了理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-1800型紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；FA2014电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；JA-20001电子天平(广州玉治仪器有限公司)； hWC-3型微波提取设备(天水华圆制药设备科技有限公司)；电热鼓风干燥箱(北京市光明医疗仪器厂)；DLSB-5/10低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；S g250 hPT超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)； h h-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；BCD-186KB冰箱(青岛海尔股份有限公司)；

1.2 材料 辣木籽经云南中医学院鉴定教研室杨竹雅副教授鉴定为辣木科辣木属植物辣木的种子；芦丁标准品(批号：PRF8012042，成都普瑞法科技开发有限公司)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝均为分析纯；纯净水(昆明娃哈哈启力饮料有限公司)。

2 方法

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 标准品溶液的制备 精密称取芦丁标准品6 m g(105℃常压干燥至恒重)于25 mL容量瓶中，用适量60%乙醇溶解，定容至刻度线，即为标准品溶液。

2.1.2 标准曲线的制备 分别取芦丁标准品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL于9个25 mL容量瓶中，各加5%NaNO2溶液1 mL，放置6 min后，加10%A1( NO3)3溶液1 mL，放置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀。以不加标准溶液的相应溶液为空白，在510 nm处测定吸光度[8-9]，绘制标准曲线。

2.1.3含量测定 将辣木籽原药材粉碎，精密称取5 g置于500 mL圆底烧瓶中，加40 mL60%乙醇回流提取2 h，收集滤液，滤渣加入30 mL60%乙醇回流提取1 h，合并两次滤液于100 mL容量瓶中，滤渣用60%乙醇洗涤3次，定容。精密量取5 mL溶液按2.2项下显色方法进行显色，测定药材中的总黄酮含量。

2.1.4 供试品溶液的制备 精密称取0.5 g辣木籽干浸膏于25 mL容量瓶中，加入适量60%乙醇，超声30 min，用60%乙醇定容至刻度。将溶液离心10 min(转速5000)，取上清液，即得供试品溶液，备用。按2.2项下显色方法进行显色，测定各浸膏中总黄酮的含量。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验方法 采用L9(34)正交试验法，以辣木籽浸膏中总黄酮的转移率为评价指标。称取药材9份，每份50 g，按正交试验表进行提取[10-12]，每份药材提取后过滤，合并滤液，浓缩滤液并干燥至干燥浸膏。按3.4项下浸膏的处理方法，进一步测定浸膏中总黄酮的含量并计算其相应的转移率。

2.2.2 微波提取法正交试验设计 通过单因素实验，确定微波提取的功率为10 KW，并确定该提取方法的4个影响因素：提取时间(3 min，5 min，7 min)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇浓度(60%，70%，80%)；提取次数(1次，2次，3次)。见表1。

表1 微波提取法正交试验因素水平

2.2.3 回流提取法正交试验设计 通过单因素实验，确定了该提取方法的4个影响因素：提取时间(1 h，1.5 h，2 h)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇浓度(60%，70%，80%)；提取次数(1次，2次，3次)。见表2。

表2 回流提取法正交试验因素水平

2.2.4 超声提取法正交试验设计 通过单因素实验，确定超声提取的功率为500 W，并确定该提取方法的4个影响因素分别为：提取时间(33 min，45 min，60 min)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇浓度(60%，70%，80%)；提取次数(1次，2次，3次)。见表3。

表3超声提取法正交试验因素水平

水平因素提取时间(A)乙醇用量(B) 乙醇浓度(C)提取次数(D)130min6倍60%1245min8倍70%2360min10倍80%3

2.3 验证性实验 取3份药材，每份2 kg，按照正交试验所筛选出的提取工艺进行提取，滤液浓缩并烘干至干浸膏，取适量干浸膏于25 mL容量瓶中，按3.4项下浸膏处理方法将浸膏处理成供试品溶液，取适量供试品溶液按3.2项下黄酮显色方法进行显色，测定各份供试品溶液的吸光度，并计算浸膏中总黄酮的转移率。

3 结果

3.1 药材总黄酮含量 按上述方法测得辣木籽药材中总黄酮的含量为0.11%。

3.2 标准曲线 标准曲线方程为A=7.5868C-0.003(R2=0.9993)，结果表明：芦丁在0.0048～0.0384 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

3.3 正交试验结果

3.3.1 微波提取法正交试验结果 通过正交试验选出微波提取法提取辣木籽药材中总黄酮的最佳工艺条件。见表4、表5。由表5可见，因素A、B、C、D的P值均<0.05,表明微波提取法中的提取时间、乙醇用量、乙醇浓度、提取次数对辣木籽总黄酮的转移率的影响均有统计学意义。由表5中方差的大小可知各因素影响的大小顺序为D(提取次数)>B(乙醇用量)>A(提取时间)>C(乙醇浓度)。其中，因素A的第1水平最好，因素B的第3水平最好，因素C的第3水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最终确定最佳工艺条件为A1B3C3D2，即微波提取时间为3 min，乙醇用量为10倍量，乙醇浓度为80%，提取次数为2次。

表4 微波提取法正交试验结果

表5 微波提取法正交试验方差分析

3.3.2 回流提取法正交试验 通过正交试验选出回流提取法提取辣木籽药材中总黄酮的最佳工艺条件。见表6和见表7。由表7可见，因素A、B、C、D的P值均<0.05,表明回流提取法中的提取时间、乙醇用量、乙醇浓度、提取次数对辣木籽总黄酮的转移率的影响均有统计学意义。由表7中方差的大小可知各因素影响的大小顺序为C(乙醇浓度)>D(提取次数)>A(提取时间)>B(乙醇用量) 。其中，因素A的第3水平最好，因素B的第3水平最好，因素C的第2水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最终确定最佳工艺条件为A3B3C2D2，即回流提取时间为2 h，乙醇用量为10倍量，乙醇浓度为70%，提取次数为2次。

表6 回流提取法正交试验结果

表7 回流提取法正交试验方差分析

3.3.3 超声提取法正交试验 通过正交试验选出超声提取法提取辣木籽药材中总黄酮的最佳工艺条件。见表8和表9。由表9可见，P<0.05表明超声提取法中的提取次数对辣木籽总黄酮的转移率有显著影响,而 PA、PB、PC>0.05,表明提取时间、乙醇用量、乙醇浓度对辣木籽总黄酮的转移率的影响不显著。由表9中方差的大小可知各因素影响的大小顺序为D(提取次数)> C(乙醇浓度)>A(提取时间)>B(乙醇用量) 。其中，因素A的第3水平最好，因素B的第2水平最好，因素C的第2水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最终确定最最佳工艺条件为A3B2C2D2，即超声提取时间为60 min，乙醇用量为8倍量，乙醇浓度为70%，提取次数为2次。

表8 超声提取法正交试验结果

表9 超声提取法正交试验方差分析

3.4 3种提取方法比较 通过对比3种提取方法发现，微波提取法和回流提取法的转移率与超声提取法的转移率相比显著偏高(P<0.05)，微波提取法的转移率与回流提取法的转移率相比无显著差异(P>0.05)，故为提高辣木籽中总黄酮的转移率、简化提取步骤、缩短实验时间，确定最佳提取条件为：微波提取法提取2次，每次3 min，溶剂为10倍量的80%乙醇。

3.5 验证性实验 由表10可知，在最佳工艺条件下，最后所得辣木籽浸膏中总黄酮的转移率为93.89%。

表10 验证性实验结果

4 分析与讨论

分光光度法测定黄酮含量的常用方法有Al(NO3)3法和AlCl3法[13]，为了选择合适的测定方法，在正式实验前进行了预实验，结果显示Al(NO3)3法比AlCl3法具有更高的稳定性、重复性和准确度，故选择Al(NO3)3法在510 nm处测定吸光度，从而计算供试品溶液中总黄酮的含量。

测定辣木籽中总黄酮的含量时，首先对提取方式进行单因素实验，考察回流提取法、微波提取法以及超声提取法这3种提取方法对辣木籽总黄酮的提取效率。结果显示，回流提取法具有最高的提取效率；微波提取法的提取效率较低可能由于含量测定时所取药材的量较少，在微波提取设备中浪费严重，导致含量测定误差较大；超声提取法的提取效率最低可能是由于提取温度或超声仪的频率较低，导致黄酮类化合物不易溶出。选用回流提取法测定总黄酮含量时，比较了药材脱脂与不脱脂两种方法的提取效率，结果显示两种方法之间不存在显著性差异，可能是因为油脂类成分在Al(NO3)3显色条件下不发生显色反应，在510 nm处不吸收紫外光。

本文前期通过单因素实验，分别确定了微波提取法、回流提取法和超声提取法中各因素的水平范围，后分别对3种方法进行了正交试验。对各提取方式的正交试验进行重复实验时，部分组别的3次数据之间误差较大，导致这一误差的原因可能是：一是提取过程中滤渣损耗较大或滤液在转移过程中浪费严重；二是供试品处理过程中，供试品溶液在离心之后上清液依然含有少量悬浮物，导致测定供试品吸光度时存在较大差异；三是供试品溶液在测定吸光度前放置时间较长，稳定性下降，导致吸光度数据不稳定。

根据实验结果，本实验优选的最佳工艺为微波提取法提取2次，每次3 min，溶剂为10倍量的80%乙醇。验证实验结果表明，总黄酮的提取率都得到了提高，说明所选的工艺是稳定而有效的，为辣木籽的进一步研究开发提供了科学依据。