蓝布正提取物对老年痴呆模型小鼠学习记忆能力及海马区TNF-α、AKT表达的影响

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1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵阳中医学院基础医学院，贵州 贵阳 550025

蓝布正为蔷薇科水杨梅属植物柔毛路边青GeumjaponicumThunb.var.chinense Bolle 的干燥全草，在我国苗族地区民间常用来治疗头痛头晕。2015年版《中国药典》[1]记载，具有益气养血的作用，临床上常用于气血亏虚。蓝布正对大脑缺血缺氧具有改善作用，能有效缓解血虚导致的眩晕症状，有改善对大脑供血供氧及耐眩晕的作用[2]。研究表明蓝布正对血管性痴呆大鼠的神经细胞具有明显的保护作用[3-4]，能改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[5]。

阿尔茨海默症，是以无意识的记忆力缓慢下降为主要临床表现的一种进行性中枢神经系统退行性疾病[6]。随着我国老龄化人口的增长，阿尔茨海默症的患病率逐年上升，据统计数据表明，2010年中国的阿尔茨海默病患者数量已如中国的人口数跃居世界第一位，2015年世界阿尔茨海默症报告显示，到2050年全球老年痴呆患者从目前的4600万人增长至1.315亿人口[7]，并以低收入和中等收入国家发病率最为明显[8]，而以拉丁美洲、中国、印度等国家的增长幅度最高，将超过300%[8]。阿尔茨海默症已成为患者和家庭的沉重负担，给家庭和国家带来沉重的经济压力。防治药物严重缺乏以及药物副反应已成为各国家治疗该病的挑战，以此为目标的新药研究旨在减轻家庭及社会的经济压力。笔者前期的动物实验研究结果观察，蓝布正在对血管痴呆的防治有一定的效果，以此来观察是否对老年痴呆也有很好的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级KM雄性小鼠54只，体重约18～22 g，购置重庆解放军第三军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK(军)2012-0011。

1.2 药品与试剂 蓝布正(采集贵州产蓝布正，经贵阳中医学院药学院鉴定实验室刘刚副教授鉴定为蔷薇科水杨梅属植物柔毛路边青GeumjaponicumThunb. var. chinense Bolle)，吡拉西坦片(批号：717H016，杭州民生药业有限公司)，D-半乳糖(批号：0902c052，BeiJing solarbio)，亚硝酸钠(批号：170801，四川金山制药有限公司)，TNF-α(批号：ab34674，abcam公司)，AKT抗体(批号：ab38449，abcam公司)。

1.3 仪器 Morris水迷宫(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，KD-BM型包埋机(浙江金华科迪有限公司)，R-1010型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，RM2245型石蜡切片机(德国Leica公司)，XSZ-HS3型显微镜(重庆光学仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 老年痴呆小鼠模型的制备 适应性喂养2天，将54只小鼠进行Morris水迷宫筛选，去除先天愚笨，游泳耐力很差的小鼠。经水迷宫筛选后所有小鼠合格，未见先天愚笨及耐力差的小鼠。将合格小鼠随机分为6组，正常对照组(I组)、模型对照组(II)、阳性对照组(III)、蓝布正高(IV)、中(V)、低(VI)剂量组。根据文献[9-10]制备AD模型小鼠。除正常对照组注射等体积生理盐水，其余各组皮下注射D-半乳糖联合腹腔注射亚硝酸钠，造模的同时给予灌胃相应药物，除正常和模型对照组灌胃等体积生理盐水，其余各组灌胃相应药物，共60 d。

1.4.2 morris水迷宫检测 第61天进行Morris水迷宫检测，向Morris水迷宫内灌水，水深刚好淹没安全平台1 cm，水温保持在(24±1)℃。整个水迷宫分为4个象限，每个象限设有一个不同的标志物供学习记忆。每次训练时，从平台所在象限的正对象限内的任意地点将小鼠放进池中，投放小鼠时，使小鼠面向池壁。小鼠从下水到找到安全平台的时间为逃避潜伏期，设为90 s，超过潜伏期未找到安全平台者，则记为90 s。下水前3天进行适应性训练，每天2次，第4天正式测试其逃避潜伏期，第5天撤出安全平台，观察其穿越安全平台的次数。

1.4.3 免疫组化检测 Morris水迷宫完成的第2天，使用4%的水合氯醛0.1 mL/10g麻醉小鼠后，摘取大脑，用4%的多聚甲醛固定后，经脱水、透明、石蜡包埋、切片后进行免疫组化检测。通过4个视野的积分吸光度IA平均值来反映炎症因子TNF-α、AKT的表达量。

2 结果

2.1 Morris水迷宫结果 与正常对照组比较，模型对照组逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组和用药高、中剂量组逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数显著增加(P<0.05)。各组小鼠游泳轨迹，与空白组相比，模型组小鼠游泳轨迹杂乱没有秩序。见表1，如图1所示。

组别剂量/g/kg逃避潜伏期/s穿越平台次数/次Ⅰ组-48.06±27.566.00±2.40Ⅱ组-81.13±17.02△1.44±1.34i△△Ⅲ组0.850.00±32.93*4.11±1.91*Ⅳ组1051.96±28.22*4.11±2.47*Ⅴ组5.049.52±28.75*4.00±1.50*Ⅵ组2.557.39±29.93 2.89±2.28△△

注：与正常对照组比较(I组)比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型对照组(II组)比较，*P<0.05。

2.2 对脑组织海马区TNF-α表达的影响 TNF-α阳性颗粒呈棕黄色，主要在细胞质中表达。造模60天后，与正常对照组比较，模型对照组小鼠TNF-α表达显著增高(P<0.01)，神经细胞排列紊乱，结构欠清晰，表明D-半乳糖联合亚硝酸钠诱发小鼠脑组织炎症损伤，成功建立了老年痴呆模型；与模型对照组比较，蓝布正高剂量组TNF-α的表达显著降低(P<0.05)，表明高剂量蓝布正提取物可提高抗炎症损伤能力，改善小鼠脑组织损害状况。见表2，如图2所示。

2.3 对脑组织海马区AKT表达的影响 AKT阳性颗粒呈棕色或棕黄色，主要在细胞浆中表达，与正常对照组比较，模型对照组小鼠AKT表达显著增高(P<0.01)，神经细胞排列松散，表明D-半乳糖联合亚硝酸钠可造成脑组织缺血缺氧，诱发小鼠脑组织炎症损伤，成功建立了老年痴呆模型；与模型对照组比较，阳性对照组、蓝布正高、中、低剂量组AKT表达有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，表明高、中、低剂量蓝布正提取物可提高抗炎症损伤能力，改善小鼠脑组织损害状况。表2，如图3所示。

组别剂量/g/kgTNF-α/IAAKT/IAI组-0.05±0.030.08±0.06II组-0.41±0.19△△0.46±0.30△△III组0.80.35±0.270.16±0.21**IV组100.15±0.16*0.09±0.07**V组5.00.37±0.270.22±0.29*VI组2.50.43±0.350.15±0.06**

注：与正常对照组比较(I组)比较，△△P<0.01；与模型对照组(II组)比较，*P<0.05，**P<0.05。

3 讨论

肿瘤坏死因子(TNF)在消耗性疾病中起了重要作用，又称恶液质素。 TNF-α的生物学活性占TNF总活性的70 %～95 %,目前常说的TNF多指TNF-α。在缺血缺氧性脑血管疾病的发生发展过程中炎症细胞因子TNF-α起着重要作用[11]。动物实验发现，脑组织在缺血缺氧病理生理过程中，存在多种炎症因子的参与反应，导致缺血缺氧时脑细胞的损伤和坏死，脑组织缺血缺氧同时又加快炎症反应，从而形成一个循环过程[12]。研究证实 TNF-α在脑损伤后高度表达，并与脑组织病变的严重程度密切相关[13]。TNF-α是炎症反应的重要介质，在中枢神经系统中的分泌可引起其他炎症因子如IL-6 等的释放，在机体炎症启动、维持和消退中起着重要作用[14]。该研究中观察到，模型对照组小鼠脑组织中TNF-α明显增加，出现学记忆能力下降。

AKT的产生与AD的发病有一定关系。AKT与脑缺血所产生的氧自由基、炎症反应等因素有关，并参与脑缺血的病理过程。AKT不但参与炎症损伤还参与细胞凋亡。Girifn等[15]发现在AD患者脑内AKT活性的升高及下游底物的磷酸化可能与AD疾病的发生有关。TNF-α通过 PI3K/AKT信号传导通路活化NF-κB，最终引发过度的组织炎症反应和损伤[16]。D-半乳糖联合亚硝酸钠能使小鼠大脑缺氧而发生炎症反应。实验结果显示，连续2个月的造模方法，成功建立了老年痴呆小鼠模型。从炎症角度建立老年痴呆模型也在一定程度上顺应了有关学者提出的老年痴呆患者大脑中炎症致病因素。前期实验观察蓝布正能够改善大鼠因大脑缺血而造成的学习记忆力障碍。有研究报告观察蓝布正在抗炎方面也体现了其较好的抗炎效果[17]。从本实验观察蓝布正提取物能够改善小鼠大脑缺血缺氧，下调炎症因子的表达，减轻炎症反应。

综上，蓝布正提取物可用于改善大脑缺血缺氧状况，减轻炎症反应，但其具体的作用机制还需要进一步的研究探讨。