HPLC法测定鳖甲消痔胶囊中没食子酸的含量

云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

鳖甲消痔胶囊由地榆、地瓜藤、黄柏、土大黄、鳖甲、槐角、忍冬藤、栀子八味中药配伍而成，具有清热解毒、凉血止血、消肿止痛的功效。用于湿热蕴结所致的内痔出血、外痔肿痛、肛周瘙痒。文献查询发现，目前对该制剂的研究主要有：用TLC法对大黄、地榆、槐角、栀子进行鉴别；用高效液相色谱法测定制剂中盐酸小檗碱的含量[1-2]。为了进一步研究该制剂，笔者选取该制剂中一种臣药地榆，建立HPLC法测定地榆中没食子酸的含量。地榆属蔷薇科植物，采挖后除去须根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。具有凉血止血、解毒敛疮之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、痈肿疮毒等症。有文献[3-4]对地榆的抗炎抑菌作用进行了研究，研究表明地榆对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌，甲型链球菌等细菌具有很好抑制作用。地榆中化学成分主要为鞣质类、三萜皂苷类、黄酮类[5]，其中鞣质类化合物是地榆的主要有效成分，没食子酸是鞣质的重要组成成分，也是评价地榆质量的主要指标[6]。没食子酸是自然界中广泛存在的一种多酚类化合物。有研究表明，没食子酸具有止血、抗炎、抗突变、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、杀锥虫等多种生物活性[7-8]。有研究证实没食子酸体外对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用[9-10]。本实验建立高效液相色谱法测定鳖甲消痔胶囊中没食子酸含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AgiLent1260高效液相色谱仪(配置四元泵、自动进样器、UV检测器)；ThermoC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS105电子分析天平(梅特勒上海公司)。

1.2 试药 没食子酸(90.1%，批号：110831-200803，中国食品药品检定研究院)。鳖甲消痔胶囊(批号：1511014、1511038、2576004，贵州汉方药业有限公司)。流动相用试剂为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：ThermoC18(250×4.6 mm，5 μm；流动相：流动相0.025%磷酸-甲醇(95.5∶4.5)；流速1.0 mL/min；检测波长272 nm；柱温25℃；进样量：5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸10.34 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1863 mg/mL没食子酸储备液。精密吸取没食子酸储备液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸对照品使用液。

2.2.2 供试品溶液制备 取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定,混匀，取约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%盐酸溶液10 mL，振摇，加入30 mL纯化水，摇匀，置于电炉上煮沸20 min，取下，冷却至室温，过滤，收集滤液置于50 mL容量瓶中。用水洗涤滤渣，合并滤液于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品制备 按处方各药材比例及制法，制得不含地榆的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验 分别取供试品溶液、对照品溶液，按上述色谱条件实验，对系统适用参数进行考察，没食子酸理论板数为6893。理论板数大于2000[1]。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下的没食子酸对照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度；摇匀，即得系列质量浓度的对照品溶液。在2.1项下的色谱条件下测定。以没食子酸浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，经线性回归，回归方程为Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。结果表明：没食子酸在0.9316～46.58 μg/mL范围内具有良好的线性关系。对照品、供试品、阴性对照的色谱图见图1。

2.5 精密度试验 取同一浓度的对照品溶液，在2.1项色谱条件下连续进样测定6次，记录没食子酸峰面积，其RSD为0.8%(n=6)。

2.6 稳定性试验 取同一在2.2.2项下制备的样品，在2.1项下色谱条件下分别于2、4、8、16、24 h进样5 μL，记录峰面积，结果测得没食子酸峰面积RSD为0.8%。表明样品在24 h稳定。

2.7 重复性试验 取同一批号样品(批号:2576004)，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定，测得没食子酸含有量RSD为1.2%(n=6)。

2.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的鳖甲消痔胶囊(批号2576004)6份，每份约0.4 g,置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.4209 mg/mL的没食子酸对照品溶液2.5 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品测定结果 取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定，混匀，取约0.8 g，精密称定，平行3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下测定，计算含有量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/粒，n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取没食子酸对照品溶液在200～400 nm范围内进行紫外扫描，没食子酸在272 nm处有最大吸收，与中国药典地榆含量测定项下选用波长一致，故选择272 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择 首先尝试了甲醇和水做流动相，经进样检测，结果峰型不好，然后参考中国药典[1]地榆含量项下流动相甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)，发现峰型变好，但目标峰与相邻的杂峰分离不是很好，而且杂峰较多，查阅相关文献[11-13]，改变磷酸溶液浓度为0.025%，发现峰型变好，分离度符合要求，故选择0.025%磷酸-甲醇(4.5∶95.5)作为流动相。

3.3 提取方式的选择 通过参考中国药典[1]和文献[14-15]，尝试用水和不同浓度(30%、50%、70%)的乙醇作为提取溶剂，煮沸和回流两种提取方式，提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min)。结果用水做溶剂通过煮沸含量较高，三种不同浓度乙醇回流含量无明显差异且比水煮沸含量低。提取时间20 min、30 min、40 min含量无明显变化。但同时发现以上几种提取出的供试品中目标峰型较差，而且杂峰多，查阅相关文献[16-17]了解到PH对没食子酸稳定性影响较大，没食子酸在酸性条件下稳定，随PH值增加稳定性逐渐下降，碱性条件下极不稳定。尝试加入不同浓度(2%、5%、10%、15%)的盐酸溶液。盐酸溶液加入体积有5、10 mL两种。结果发现加入10%盐酸溶液10 mL,没食子酸含量测定值最高且与加入15%盐酸溶液10 mL无明显差异。综合以上实验，确定了本法的提取方式。