金黄色葡萄球菌VII型分泌系统研究进展

张保海，姚学萍，王 印,2，杨泽晓，罗梓丹，项明源，江地科

金黄色葡萄球菌可引起动物和人类多种疾病，是人兽共患重要病原菌之一，其自身携带的多种毒力因子与其致病力有紧密联系，而这些毒力因子的分泌在很大程度上则依赖于细菌分泌系统，在革兰氏阳性菌蛋白分泌中发挥重要作用主要是VII型分泌系统。

1 Ⅶ型分泌系统的发现

革兰氏阴性菌的蛋白分泌异常复杂，因为这些细菌有两层膜结构，这些蛋白质必须通过这两层膜进入细胞外环境或宿主细胞。与革兰氏阴性细菌相比，分枝杆菌在其表面存在大量羟基化支链脂肪酸称为分枝菌酸，分枝菌酸共价连接到细胞壁基质形成第2个疏水屏障，称为分枝菌酸膜，而蛋白分泌要跨越分枝菌酸膜就需要1种特殊的蛋白分泌系统，最近的研究证明革兰氏阳性细菌中存在专门的蛋白分泌系统，即细菌VII型分泌系统[1-2]。Ⅶ型分泌系统(Type Ⅶ Secretion System，T7SS)首次在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中发现，T7SS系统中的ESX-1系统分泌两种小蛋白质(ESAT-6和CFP-10)，现已分别命名为EsxA和EsxB，并且已证明它们在细菌毒力分泌方面发挥重要作用[3]。除了分泌EsxA 和EsxB蛋白之外，分枝杆菌T7SS还可以分泌更大的脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-glutamicacid，PE)/脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-proline-glutamic acid，PPE)家族蛋白，这些蛋白质在某些物种的基因组中是大量存在的[4-5]。通过对ESX-1基因座进行鉴定，还确定了在一个物种中存在多达5个不同位点的同类基因座，称为ESX-1至ESX-5[6]。虽然在分枝杆菌中可以存在5个不同的ESX基因座，但大多数物种的ESX基因座数量较少。ESX-1和ESX-5两个系统参与细菌毒力分泌，也会影响致病性分枝杆菌在细胞间迁移[2-3]。ESX-5系统作为分枝杆菌最活跃的分泌系统，它的存在可能与分枝杆菌快速增长的差异相关；ESX-3系统参与细菌体内锌、铁平衡； ESX-5、ESX-3和ESX-1参与蛋白质的分泌；ESX-2和ESX-4的功能目前尚不清楚[3,5]。然而，近年的研究发现金黄色葡萄球菌基因组中也存在与结核分枝杆菌ESX基因同源的基因簇[7-8]。金黄色葡萄球菌外毒素、表面蛋白和调节分子是重要的毒力因子，EsaB和EsaC基因在调节这些因子方面取得了很大进展[2,5]。对于金黄色葡萄球菌中的许多毒力因子，Ess簇的调节也是比较复杂的。

2 金黄色葡萄球菌T7SS及功能

金黄色葡萄球菌基因组编码专门的分泌系统ESS(ESAT-6分泌系统)，ESS蛋白分泌系统促进效应蛋白通过细菌包膜转运，也是金黄色葡萄球菌建立持续性脓肿病变和血液感染期间免疫应答调节所必需的，该系统包括8个基因簇(esxAB、essABC、esaABC)(图1)[9-10]。ESS编码的esxA、esxB、esaC参与膜蛋白的稳定表达，这些基因指定了3种分泌的多肽底物[4-5]。此外，EsxA和EsxB的分泌相互关联，EsxA的分泌依赖于EsxB的存在，这种共同依赖性与结核分枝杆菌中的ESAT-6和CFP-10极其相似，而不能分泌EsxA和EsxB的金黄色葡萄球菌突变体的毒性则显著降低，并存在传播和定植缺陷[8,11]。ESS基因座还包含12个编码序列(CDs)，编码跨膜蛋白的2个CDs(特别是essA和essB)同样参与蛋白分泌[4-5,12]。

蛋白的分泌既有相互协同，也存在相互抑制。如EsxA和EsxB需要EssA、EssB和EssC协作转运通过葡萄球菌包膜分泌[13]。esaB编码一种小的细胞质蛋白，有抑制esaC合成的作用，但不抑制esxA和esxB的合成；esxB可与新的底物esxD和esxA结合，与其自身或esaC二聚化；esaD位于esxB的下游，其表达通过esaB和essB的突变激活，缺乏esaD的金黄色葡萄球菌突变体显示出建立持续性脓肿病变的能力缺陷[5,14-15]。esxC是一种保守的金黄色葡萄球菌蛋白，是ESS的底物，在脓肿形成初期所发挥的作用很小，但在脓肿的长期持续中有显著作用[9,16]。未能分泌EsxA和EsxB的金黄色葡萄球菌会导致脓肿感染小鼠模型的毒力降低，表明ESS途径参与急性葡萄球菌感染的发病机制[8,12,17]。

图1 ESS基因座结构示意图[9]Fig.1 Structure of ESS Locus[9]

3 T7SS分泌底物与调控

ESX系统中只有ESX-1、ESX-3和ESX-5参与蛋白质的分泌，而经由ESX-2或ESX-4为底物的主动分泌系统还未被证实[1,18-19]。ESX基因座是以第一个被鉴定的分泌底物命名的，即EsxA。EsxA属于更大的蛋白质家族WXG100蛋白。WXG100超抗原家族还包括EsxB，EsxA和EsxB可形成二聚体螺旋发夹结构(图2)，并且在厚壁菌门中EsxA作为折叠的同型二聚体；其次EsxA和EsxB对巨噬细胞中结核分枝杆菌的复制至关重要，并且可能也与病原体抑制先天性和适应性免疫应答的能力相关[20-22]。EssC除外，另外3种膜蛋白EsaA、EssA、EssB对于T7SS分泌活性以及分泌蛋白EsxA和细胞质蛋白EsaB是必需的[23]。通过对NCTC8325 T7SS基因簇的菌株(包括金黄色葡萄球菌Newman、USA300和RN6390)进行的研究已经将EsxB、EsxC和EsxD鉴定为T7SS的分泌底物，这3种蛋白很小，仅有100～130氨基酸，它们的确切功能还有待进一步阐明[8,16-17]。

图2 ESAT-6-CFP-10二聚体的结构[20-22]Fig.2 Structure of the ESAT-6-CFP-10 dimer[20-22]

ESX系统存在5种分泌系统ESX-1～ESX-5，但却彼此不互补，这是由于4个ESX系统(ESX-2～ESX-5)无法补充由于ESX-1缺失而导致的毒性减弱或丧失[5-6,8]。这对ESX-5尤其显著，因为ESX-5和ESX-1似乎都参与了巨噬细胞的逃逸和细胞间的扩增。这可能意味着这2个分泌系统在细胞感染周期的进程中具有独立的作用。不同的ESX系统不能互补，这可能是由于它们的分泌信号的不同，以及它们的调节方式不同[8,18]。虽然5个ESX分泌系统似乎都是独立运作的，但也存在一定程度的交叉，ESX-3和ESX-5基因座编码的Esx蛋白的分泌就是很好的例证[6,8,19]。最近有研究表明，由ESX-3位点编码的EsxGH也形成与EsxAB具有相似结构特征的异二聚体[20,24]。PE和PPE蛋白虽然在结构上与ESX蛋白结构相似，但是这两种蛋白是由不同的ESX系统分泌的底物，它们也可以形成异二聚体结构，当单独表达时，单个蛋白表现不稳定[25]。虽然已证明PE和PPE蛋白会被不同的ESX系统分泌，但绝大部分似乎被ESX-5分泌，这使得ESX-5系统成为分枝杆菌中含有许多PE/PPE基因最活跃的分泌系统[4,18,20]。根据对T7SS系统折叠二聚体结构的观察，由这种“单一”esx基因编码的金黄色葡萄球菌WXG100成员之间形成同源二聚体而不是异二聚体。对于ESX-1系统而言，编码分泌底物的为esp基因(EspA-EspC、 EspE、 EspJ、EspK)，除了espA和espC位于独立操纵子之外，其他基因都位于ESX-1基因座，由于ESX-1含有多个esp基因，因此底物的变化几乎是唯一的[26-28]。

4 T7SS对金黄色葡萄球菌毒力分泌的调控

在结核分枝杆菌毒力中起重要作用的是EsxA和EsxB[29]。同时，EsxA和EsxB也是金黄色葡萄球菌感染发病所必需的，这两种蛋白是由ESAT-6系统分泌的，而ESAT-6系统是金黄色葡萄球菌专门的分泌途径，其有助于血源性感染发病[30-32]。除了WXG100蛋白EsxA和EsxB，金黄色葡萄球菌的ess基因簇还含有EssABC。同时，Ess途径也是一种交替的分泌系统，使人联想到许多病原体的交替分泌系统，这些交替分泌系统将多肽转运穿过细菌胞膜。与大多数交替分泌系统一样，Ess途径似乎只能运输有限的一组底物[8,22,33]。

EsaC是金黄色葡萄球菌分泌系统ESS分泌的底物蛋白质，essC是ESAT-6分泌系统的重要组成部分，破坏essC基因可以消除esaC的分泌和在葡萄球菌细胞质中积累的蛋白质[8,34]。利用缺少esaB的USA300和Newman菌株，将金黄色葡萄球菌的培养物分离成细胞质、细胞膜、细胞壁和培养基，并用特异性抗体进行免疫印迹揭示所有组份中的蛋白质。结果发现Newman不会产生EsaC，然而，在缺乏esaB的USA300和Newman菌株的培养基中发现了EsaC，但在细胞质、膜和细胞壁中均没有发现EsaC[8-9,14,35]。这些结果表明EsaC的产生受EsaB的调节。

有研究表明T7SS在小鼠感染模型中具有毒性，并促进细胞内金黄色葡萄球菌从上皮细胞释放[4,16]。另有研究确定了金黄色葡萄球菌T7SS在细菌竞争中发挥的作用， EsaD是T7SS的一种核酸酶毒素，其分泌依赖于辅助蛋白EsaE，在其生物合成过程中EsaD的毒性活性通过与抗毒素EsaG形成复合物而被中和[5,12,20,36]。不编码EsaD底物的金黄色葡萄球菌菌株具有esaG同源物，最有可能保护自己免受EsaD生产菌株的杀死，为了支持这个观点，研究发现过量产生EsaD的菌株引起对敏感菌株的显著生长抑制[3,15,37]。此外，esaD和esaE存在共分泌，esaG仅在细胞质中被发现并且可能在分泌过程中被剥离[14,36,38]。esaG的存在抵消了EsaD的毒性活性，表明esaG是一种蛋白质抗毒素，并且通过细菌双杂交分析证实EsaD-EsaG的相互作用，EsaG通过直接作用阻断esaD的活性；EsaG也是EsaD稳定性或分泌所必需的[5,39-40]。然而，EsaG不是分泌EsxA或EsxC所必需的，因此不是普通的T7SS辅助因子[16,41]。

T7SS表现出的这些功能可能与其一些特性存在某种联系，这些T7SS底物存在一个特殊的性质是当分泌系统被阻断时，一些蛋白质通常不会积聚在细菌细胞中[5,9,29]。这种特性在不同的ESX系统和不同的突变中较常见，表明其可能是一种保守特性，并可以感知底物的细胞质积聚[4,16,20]。由此可见，底物调控有一个特定的反馈机制，该机制不仅可以在转录起始水平上起作用，而且可能涉及RNA稳定性、蛋白质翻译起始和蛋白质稳定性。T7SS底物的另一个特性就是共依赖分泌[20]。EsxA和EsxB异二聚体的分泌取决于这两种蛋白质的存在，对于ESX-1分泌而言，这种依赖性似乎更加广泛，如EspA及其伴侣蛋白EspC的分泌依赖于EsxAB的存在，反之亦然[9,20,30]。同样的EspB的分泌取决于EspA的表达，但不依赖于EsxAB的存在[5,29-30]。然而，这种相互依赖关系未被详细研究，我们还不清楚EspB和EspA是否以共依赖的方式分泌，并且这种现象背后的分子机制尚不清楚。

5 展 望

自VII型分泌系统被发现以来，研究者围绕该系统的基因结构、分泌底物组成和功能及相关调控机制等方面进行了大量的研究。最近的研究表明单顺反子esxA转录物由sigma A(σA)启动子驱动，进而推测在Newman菌株中σB启动子是非活性的。该分析还揭示了esxA转录物在sarA突变体中积累，但在agr，arlR和spoVG突变体中减少[42-43]。因此，esxA表达受已知微调分泌蛋白组的几种转录因子调节，以便协调致病性与细菌细胞密度和环境之间的关系。目前尚不清楚为什么一些Esx蛋白质自我结合而其他蛋白质作为异二聚体相互作用，显然分泌物的一个特征是相互关联，但亚基在宿主中不相互关联。此外，结构折叠对于广泛中和抗体的诱导可能是独特和难以控制的。在金黄色葡萄球菌中，ESS途径是感染动物中、深部脓肿持续存在所必需的[5,9,23,44]。4种分泌的蛋白质必须借助于这一过程，确切功能和宿主目标仍有待确定。

金黄色葡萄球菌分泌两种WXG100蛋白，EsxA和EsxB以及第3种多肽EsaC。通过对脓肿形成小鼠模型中的EsaB和EsaC突变体分析，揭示了金黄色葡萄球菌感染期间EsaC产生和分泌的作用[2,8-9]。通过观察发现辅助因子EsaB可能有助于葡萄球菌感染的持久性。此外，葡萄球菌在进入宿主组织时产生和分泌EsaC[45]。 EsaC的产生受EsaB的调节，EsaB是在Ess簇内编码的细胞质保守蛋白[46]。 EsaB似乎以转录后的方式抑制EsaC的产生，缺乏EsaB的细菌会过量产生EsaC，而野生型细菌则不会，除非它们在宿主组织中复制[9,14]。EsaB如何介导抑制并感知环境信号仍然未知。尽管无法描述EsaB的生化功能，但EsaB不仅调节EsaC，还调节其他因素，这些因素有助于建立持续性感染[35,45]。总之，研究指出Ess基因座是金黄色葡萄球菌的新型分泌途径，其可能干扰宿主免疫应答并促进细菌建立类似于结核分枝杆菌的慢性持续性感染途径。

通过进一步探究ESAT-6因子的免疫应答是否可以保护宿主抵抗葡萄球菌的感染，或者缺乏ESAT-6决定簇的突变体是否可以用于减毒金黄色葡萄球菌菌株的活疫苗设计，该领域的工作在未来有望成为研究热点。揭示EsxA/EsxB分泌机制和EssA、EssB、EssC底物的全部特性，或者可能指出预防由金黄色葡萄球菌引起的动物和人类多种疾病的新策略，特别是耐药菌株对已知抗生素具有抗药性以及相关抗性形成的机制。

利益冲突：无