血浆hsa-miR-19a-3p表达与急性心肌梗死的相关性研究

黄 浩，陈文江2，刘长召，王 玲，王凤萍

冠心病(coronary artery disease， CAD)主要是指冠状动脉发生动脉粥样硬化所导致的心脏疾病，给病人及家庭、社会带来了沉重负担，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，为CAD中最严重的类型，其发病率逐年升高，为临床常见的心血管疾病之一，具有较高的死亡率和致残率[1-2]。据我国最新心血管疾病报告显示：我国 AMI 死亡率城市为 55.32/10万人， 农村为68.60/10 万人，而AMI 死亡率均随年龄的增高而增加，由此可见其防治显得十分重要[3-4]。目前，对于AMI的防治主要是对危险因素(高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、肥胖、大气污染和不合理膳食等)的控制和早诊断、早发现、早治疗[5]。关于AMI的诊治，目前主要依靠于临床症状、心电图和心肌酶谱等综合评估，然而我国AMI病人的诊治普遍较晚，从入院到接受急诊再灌注治疗时间存在很大的差异，入院到接受急诊冠状动脉介入治疗的中位时间为 165 min，从入院到溶栓时间为 130 min，主要可能与医院硬件设施和诊断标志物水平检测等有关。近年来，发现了一些新型的AMI生物诊断标志物，如超敏C反应蛋白、脂蛋白相关磷脂酶A2、血清卵泡抑素样蛋白1和循环微小RNA(microRNA， miRNA)等[6-9]，尤其是循环miRNA(主要是指血清、血浆和尿液等中的miRNA)与AMI的研究成为热点，有研究发现miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等[10-15]均可能与AMI发病密切相关，并可作为AMI的诊断标志物，然而各个研究纳入人群(种族、年龄和病史等)、样本量和检测方法等都不同，因而结论也尚未达成一致，还有待进一步研究。本研究拟对血浆hsa-miR-19a-3p进行检测，探讨其与AMI的相关性，并与传统心肌标志物进行比较分析，以期发现更有效的心肌损伤诊断标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 入选2015年5月—2016年10月CAD病人90例作为研究对象，其中AMI组45例，稳定型冠心病(SCAD)组45例，所有病人于入院6 h内以EDTA抗凝管抽取2 mL 静脉血；另外，对行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)术的AMI病人在术后1 d和3 d各收集2 mL 静脉血，并于4 h内进行离心(3 000 r/min，4 ℃，10 min)分离血浆，保存于-80℃冰箱，以备后续实验用。同时，收集病人入院时基本病史和生化检测指标等临床资料。

1.2 CAD诊断标准 按照《中国经皮冠状动脉介入治疗指南(2016)》[16]进行诊断和分类。入选标准[9]：经冠状动脉造影(CAG)证实3支主要冠状动脉中至少一支冠状动脉管腔狭窄>50%；行急诊PCI的AMI病人；心电图和传统心肌标志物符合AMI诊断。SCAD包括以下3类病人：慢性稳定性劳累型心绞痛；既往已明确诊断有冠心病或者最近发生休息时心绞痛，但经治疗后疼痛消失，需定期随访的稳定病人(包括变异型心绞痛、低危不稳定型心绞痛、微血管性心绞痛)；无症状或者有“缺血相当”症状(气急、左心室功能不全等)的缺血性心脏病病人。

1.3 排除标准 恶性肿瘤、脑卒中、外周血管疾病、肝肾功能不全、急性感染及患其他慢性器质性疾病病人。

1.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 采用ELISA测定血浆肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(MYO)和肌钙蛋白I(cTnI)，按照试剂盒说明书进行相关具体步骤检测。

1.5 血浆hsa-miR-19a-3p的qRT-PCR检测 采用miRNAcute miRNA提取分离试剂盒(广州真知生物有限公司)柱式分离提取并纯化其miRNA，然后按照其配套的miRNAcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(广州真知生物有限公司)将miRNA逆转录合成cDNA，最后按照miRNAcute miRNA SYBR Green荧光定量检测试剂盒(广州真知生物有限公司)及试剂盒中的下游引物进行荧光定量检测。hsa-miR-19a-3p(MIMAT0000073，UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA)的上游引物和内参U6引物(广州真知生物有限公司提供)，下游引物为试剂盒通用引物。所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行，荧光定量过程：94 ℃变性2 min；PCR循环中模板94 ℃变性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30个循环。本研究采用2-ΔCt相对定量方法进行数据分析：ΔCt(实验组)=Ct(实验组目标基因)-Ct(实验组内参基因)；ΔCt(对照组)=Ct(对照组目标基因)-Ct(对照组内参)。

2 结 果

2.1 入选研究人群基本特征情况 本研究共纳入90例研究对象，两组研究对象在年龄、性别、吸烟史、高血压等基本病史方面比较差异无统计学意义(P>0.05)；在β受体阻滞剂等基本心血管相关药物服用方面比较差异无统计学意义(P>0.05)；入院时血清肌酐和血糖比较差异无统计学意义(P>0.05)；AMI组的脂蛋白a、总胆固醇和低密度脂蛋白与SCAD组比较差异有统计学意义(P<0.05)；AMI组心肌标志物CK-MB 、MYO、cTnI与SCAD组比较明显升高(P<0.000 1)。详见表1。

表1 入选研究人群基本病史和生化检查情况比较

注：BMI为体质指数；CCB为钙通道阻滞剂；ACEI为血管紧张素转换酶抑制剂；ARB为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂

2.2 血浆中hsa-miR-19a-3p表达与CK-MB、MYO、cTnI的相关性 AMI组血浆hsa-miR-19a-3p水平(0.20±0.02)较SCAD组(0.05±0.01)明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图1A。经过Pearson相关分析发现：血浆hsa-miR-19a-3p的表达水平与CK-MB的Pearson相关系数为0.488 1，95%置信区间(confidence interval，CI)为0.312 5～0.631 4(P<0.000 1)。详见图1B。与MYO的Pearson相关系数为0.457 0，95%CI为0.275 9，0.606 7(P<0.000 1)。详见图1C。与cTnI的Pearson相关系数为0.452 2，95%CI为0.270 3～0.602 8(P<0.000 1)。详见图1D。

图1 血浆hsa-miR-19a-3p表达及其与CK-MB 、MYO、cTnI的相关性

2.3 血浆hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲线 血浆hsa-miR-19a-3p的 ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)=0.895 3，95%CI(0.825 1，0.965 6)，P<0.000 1。详见图2A。CK-MB的AUC=0.854 8，95%CI(0.774 7，0.934 9)，P<0.000 1。详见图2B。MYO的 ROC曲线的AUC=0.932 3，95%CI(0.881 6，0.983 1)，P<0.000 1。详见图2C。cTnI的ROC曲线的AUC=0.948 6，95%CI(0.901 6，0.995 7)P<0.000 1。详见图2D。hsa-miR-19a-3p截断值(cut-off)为 0.029 8，其灵敏度为44.44%(29.64%～60.00%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的cut-off值为1.884 U/L，其灵敏度为22.22%(11.20%～37.09%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的cut-off值为4.927 ng/mL，其灵敏度为53.33%(37.87%～68.34%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的cut-off值为2.897 ng/L，其灵敏度为57.78%(42.15%～72.34%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)。

2.3 AMI病人PCI术前、术后血浆中hsa-miR-19a-3p表达情况 对AMI病人行PCI术前、术后1 d及术后3 d血浆中hsa-miR-19a-3p分析发现，PCI术前血浆hsa-miR-19a-3p的表达(0.245 7±0.028 1，n=45)与术后1 d(0.195 0±0.026 1，n=42)比较差异无统计学意义(P>0.05)，而术后3 d血浆hsa-miR-19a-3p的表达(0.071 1±0.008 9，n=40)较术前比较则明显下降(P<0.05)。详见图3。

图2 血浆hsa-miR-19a-3p、CK-MB 、MYO和cTnI的ROC曲线

与术后3 d比较，*P<0.05

2.4 AMI病人血管病变支数与血浆hsa-miR-19a-3p表达情况比较 本研究共纳入AMI病人45例，经过CAG和PCI发现，其中冠状动脉单支病变病人17例，双支病变病人16例，而三支病变病人12例，通过分析发现：三支病变病人血浆中hsa-miR-19a-3p表达(0.130 4±0.007 3)，明显比双支病变(0.213 3±0.038 4)和单支病变(0.269 8±0.051 4)升高，差异具有统计学意义(P<0.000 1)；且双支病变病人hsa-miR-19a-3p表达水平与单支病变病人比较也明显升高(P<0.000 1)。详见图4。

与单支病变比较，*P<0.000 1；与双支病变比较，#P<0.000 1

3 讨 论

miRNA为一类长约22个碱基的非编码RNA，目前研究发现，大量miRNA广泛参与生物体的各种生理过程和病理过程，大量miRNA可能参与了心血管系统的发育和心血管疾病的发生、发展过程。AMI为危害人类健康的灾难性疾病，其防治随着近年来诊治水平(PCI和溶栓治疗)的开展取得了显著成效，然而我国AMI发病率和死亡率仍然呈逐年升高的趋势，因而对AMI防治研究仍然十分重要。随着miRNA研究的逐渐深入，发现miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等都可能与心血管疾病密切相关，尤其是循环miRNA的发现，为miRNA的研究开辟了新方向。有研究表明大量循环miRNA可能与肿瘤系统疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病和消化系统疾病等有关，近年来发现循环miR-1、miR-126、miR-133a/b、miR-134、miR-150、miR-19a/b、miR-197、miR-208a、miR-223、miR-320a、miR-499和miR-486等可以作为AMI的诊断生物标志物[17-21]。然而，循环miRNA作为标志物在临床的应用却很少，主要是因为各个研究纳入人群不同、采用检测方法不同和检测的miRNA也不一样，所以导致循环miRNA的应用未被推广。虽然未被推广，但是循环miRNA作为疾病诊断标志物的研究仍具有前景，随着大量研究的深入开展，有Meta分析显示，miR-499对AMI的总体敏感性为88%[95%CI(0.86，0.90)，P<0.000 1]；特异性为0.87 [95%CI(0.84，0.90)，P<0.000 1]；miR-1对AMI的总体敏感性为63% [95%CI(0.59，0.66)，P<0.000 1]；特异性为76% [95%CI(0.71，0.80)，P<0.000 1]；miR-133a对AMI的总体敏感性为89%[95%CI(0.83，0.94)，P=0.004 7]；特异性为87%[95%CI(0.79，0.92)，P=0.026 2]；miR-208b对AMI的总体敏感性为78%[95%CI(0.76，0.81)，P=0.058 1]；特异性为88%[95%CI(0.84，0.91)，P<0.000 1]；说明循环miRNA确实具有作为诊断疾病生物标志物的潜能[22-23]。

本研究发现，AMI组血浆hsa-miR-19a-3p水平较SCAD组明显升高(P<0.05)，发现其与CK-MB的Pearson相关系数为0.488 1(P<0.000 1)，与MYO的Pearson相关系数为0.457 0(P<0.000 1)，与cTnI的Pearson相关系数为0.452 2(P<0.000 1)；并发现血浆hsa-miR-19a-3p的AUC为0.895 3(P<0.000 1)，其灵敏度为44.44%(29.64%～60.00%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；CK-MB的AUC为0.8548(P<0.000 1)，灵敏度为22.22%(11.20%～37.09%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；MYO的AUC为0.932 3(P<0.000 1)，灵敏度为53.33%(37.87%～68.34%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)；cTnI的AUC为0.948 6(P<0.000 1)，其灵敏度为57.78%(42.15%～72.34%)，特异性为97.78%(88.23%～99.94%)，由此可见，血浆hsa-miR-19a-3p可能与AMI的发病有关，在AMI中呈现明显差异性表达，而且可以作为AMI的诊断标志物，具有较高特异性。

同时发现血浆hsa-miR-19a-3p在PCI术后3 d明显下降，可能具有判断AMI病人预后的价值；通过冠状动脉主要血管病变数量分析发现，三支病变病人血浆中hsa-miR-19a-3p表达明显比双支病变和单支病变病人升高(P<0.000 1)；而且双支病变病人hsa-miR-19a-3p表达水平与单支病变病人比较也明显升高(P<0.000 1)，该结果说明血浆hsa-miR-19a-3p的表达可能与AMI病人心脏血管病变数量有关，可能具有反映心脏病变程度的潜力。

然而，本研究只是一个小样本的研究，还有待大样本实验的进一步验证；而且发现血浆hsa-miR-19a-3p在AMI组和SCAD组的明显差异性表达，然而其可能机制还未进行探讨和探究。本研究显示，血浆hsa-miR-19a-3p作为AMI标志物的敏感性较低，但是特异性并不低于传统心血管心肌酶。随着非编码RNA研究的深入，长链非编码RNA(Long non-coding RNAs， lncRNAs)和环状RNA(Circular RNAs， circRNAs)等新型非编码RNA也被发现，而且发现lncRNAs和circRNAs也与心血管疾病的发生密切相关，也发现了部分lncRNAs和circRNAs可以作为心血管疾病的诊断标志物[24-27]，如果能够结合miRNAs、lncRNAs和circRNAs共同来作为生物标志物，可能具有更大意义，也可能揭示心血管疾病新的发病机制，为心血管防治开辟新途径和新方法。

综上所述，血浆hsa-miR-19a-3p可能与AMI发病密切相关，并可以作为AMI的新型诊断生物标志物。