表没食子酸儿茶素没食子酸酯对高脂饮食引起的高血脂大鼠的保护作用研究

血脂含量可以反映人体内脂类代谢的情况，血浆三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平的升高即高脂血症，特别是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的升高，被认为是导致动脉粥样硬化发展的重要因素，此外，还可直接导致心绞痛、心肌梗死和脑血栓、脑动脉硬化等症。动脉粥样硬化又是心肌梗死和脑梗死发病的主要因素之一[1-2]。高脂血症病人应注意科学饮食，少食高脂肪和高糖食物。绿茶因其药理和营养特性而闻名，是中国和东亚地区最受欢迎的饮料之一[3]，其主要化学成分是茶多酚(30%干重)[4]。多酚对包括癌症、炎症、糖尿病和心血管疾病在内的病理状况具有多种治疗作用[5-6]。近年来，对多酚的科学兴趣迅速增加，绿茶中的茶多酚含有大量的儿茶素，包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯、表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)。在这些组分中，EGCG是茶多酚中最丰富的成分，与其他茶叶中的儿茶素相比，EGCG和ECG是生物活性研究最多的化合物[7]。EGCG的化学结构见图1。人们相信喝绿茶有益于健康，并且已经证明EGCG在许多异常变化方面具有抑制作用，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗胶原酶，抗纤维化作用，对成骨的促进作用等[8-11]。尽管如此，目前关于EGCG的研究还处于起步阶段，虽然普遍意识到EGCG有利于人体健康，但是很多药理活性及其机制尚不明确，本研究旨在探讨EGCG对高脂饮食喂养大鼠胆固醇水平和血管反应性的影响。

在临床应用EGCG预防及治疗高脂血症之前，需要明确其作用，并确定其作用机制。本研究旨在探讨EGCG对胆固醇喂养大鼠血管反应性改变的可能良性作用，以及EGCG对血浆胆固醇水平的降低作用与其是否存在相关性及对血管反应性的影响，分析EGCG的降血脂活性和作用机制。

图1 EGCG的化学结构示意图

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，SPF级，体重180～200 g，由北京市维通利华实验动物中心提供。所有动物实验均遵循实验动物的伦理要求和实验动物管理条例。

1.2 实验药品与试剂 EGCG、氯乙酰胆碱、重酒石酸去甲肾上腺素和SNP购自美国Sigma公司(纯度≥99%)；其他试剂(分析纯)购于北京试剂厂。磷酸缓冲盐溶液(PBS)为本实验室配制；蒸馏水由Milli-Q超纯水系统制得。

1.3 仪器 X-20减震型闭循环低温恒温器(天津多为莱博科技有限公司)；16通道小动物生理仪(BIOPAC公司)；Leica CM1520冰冻切片机(徕卡显微系统上海贸易有限公司)；DW-86L30超低温冰箱(杭州艾普仪器设备有限公司)； Muromachi 尾套法血压测定仪(香港生科仪有限公司)；微孔板读数仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)；HNY-200B台式全温度恒温高速培养摇床(北京傲松欣实验室设备有限公司)；Eppendorf-5424小型高速离心机(北京东南仪诚实验室设备有限公司)；Olympus SZ61/51 体视显微镜(奥林巴斯北京服务有限公司)；Milli-Q 超纯水系统(美国 Millipore 公司)。

1.4 动物分组及给药处理 雄性Wistar大鼠60只，随机分为5组，每组12只，体重(200.0±20.5)g。大鼠饲养在空调动物房内，人为控制时间周期为12 h光照/12 h黑暗。所有大鼠最初均喂饲标准实验室饮食至少7 d，之后对照组继续给予标准饮食(正常对照)。高脂饮食组饲喂标准饮食加0.5%胆固醇。大鼠自由摄取自来水。将实验大鼠随机分配至高脂饮食组和EGCG处理组(高、中、低剂量)，每天喂食不同剂量的EGCG。实验持续16周。每天监测对照组和药物治疗组的食物摄入量。所有相关动物的实验及操作均符合实验动物伦理委员会的规定。

1.5 体重和生化指标测定 从大鼠颈静脉收集血液；每只大鼠在开始实验之前即称体重，之后在高脂饮食或EGCG处理后每15 d测量并记录体重。测定EGCG对血清TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及LDL-C。通过检测试剂盒测定大鼠血清中卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)、心肌脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)活性以及肝脏3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶活性。实验结束时，处死大鼠，对心脏、肝脏和肾脏进行称重，并计算器官-体重比，以百分比表示。

1.6 离体血管取样保存 经过16周实验后，大鼠用乙醚麻醉并处死。将胸主动脉快速移除并置于试剂中，Krebs-Henseleit溶液组成：NaCl 119 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，MgSO41.0 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L。

1.7 主动脉环制备及血管反应性测定 将附着于大鼠胸主动脉的脂肪和周围组织清理干净，将动脉切成2～3 mm宽的环。然后将主动脉环悬挂在两个不锈钢钩中，在10 mL Krebs Henseleit溶液中的脏器浴中。将溶液温度保持在(36.0±0.5)℃，用95%O2-5%CO2气体混合物连续喷淋。主动脉环安装在1 g张力下，用每种制剂平衡60 min，用力位移传感器等距测量收缩反应。等距力也通过MacLab A/D转换器数字化，存储并显示在Macintosh计算机上。血管反应性测定实验步骤：在平衡期后，主动脉环与去甲肾上腺素(NE，10-6mol/L)收缩，当收缩达到平台时暴露于乙酰胆碱(ACh，10-8mol/L)或硝普钠(SNP，10-8mol/L)以测试内皮依赖性和独立性。

2 结 果

2.1 EGCG对机体和脏器重量的影响 各组大鼠体重情况见图2a，在实验过程中各组大鼠体重都增加，而各组别之间体重的数据差异无统计学意义。心脏重量/体重比值见图2b，各组间差异无统计学意义。然而，与高脂饮食组相比，EGCG高、中、低剂量组的肝脏/体重比率均降低(见图2c)。此外，肾脏重量/体重比值(见图2d)在高脂饮食组大鼠中有显著增加，而EGCG处理后可显著降低肾脏重量/体重比。

C为对照组；M为高脂饮食组；1为EGCG低剂量组；2为EGCG中剂量组。3为EGCG高剂量组所有数据均为相对值，以对照组计为100%。与对照组相比，*P<0.05；与高脂饮食组相比，# P<0.05

2.2 EGCG对高脂饮食大鼠血脂的影响 在研究开始时，以血浆血脂浓度1.50 μmol/L计为100%，在实验结束(16周)时，高脂饮食组显著升高。EGCG组大鼠血浆TC均降低，且具有明显剂量依赖性。详见图3。

C为对照组；M为高脂饮食组；1为EGCG低剂量组；2为EGCG中剂量组；3为EGCG高剂量组所有数据均为相对值，以对照组计为100%。与对照组相比，*P<0.05；与高脂饮食组相比，#P<0.05

图3EGCG对大鼠血清血脂含量的影响

2.3 EGCG对高脂饮食大鼠血液流变学的影响 EGCG处理对NE(10-6mol/L)或KCl(80 mmol/L)诱导主动脉收缩的影响。在每一组实验中，测定NE(10-6mol/L)或KCl(80 mmol/L)引起的收缩，高脂饮食组动脉内皮素诱发的收缩较对照组明显增加[(0.96±0.09)g与(1.28±0.08) g，P<0.05，n=8]。此外，EGCG处理组的收缩率高于高脂饮食组，EGCG低剂量组(RG-HP20-w)收缩率虽没有显著降低，但与高脂饮食组[(1.28±0.08)g 与(1.10±0.10)g]相比有所降低。

2.4 EGCG对高脂饮食大鼠血清中LCAT、HL、LPL的影晌(见表1)

组别只数LCATHLLPL对照组81.742±0.139 16.46±1.45 46.12±0.26高脂饮食组80.842±0.0351)8.51±0.471)21.18±0.261)EGCG低剂量组81.040±0.08712.24±0.8939.36±0.512)EGCG中剂量组81.361±0.1012)17.31±0.933)45.33±0.473)EGCG高剂量组81.746±0.1333)17.39±0.523)47.15±0.353)

与对照组相比， 1)P<0.05；与高脂饮食组相比，2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨 论

高脂血症是心脑血管疾病的危险因素之一。高血脂病人用药要根据自身情况而定，但是临床证明目前治疗高脂血症的药物缺乏理想的作用，而且副作用明显[12]。流行病学和实验研究提示，长期食用高胆固醇食物易引起高TG、TC血症。血清TG升高是冠心病的重要危险因素，LDL -C水平升高与动脉粥样硬化的发病率呈正相关，而HDL-C具有消除胆固醇的作用[13]。据统计，茶叶全球年销售额超过430亿美元，其中超过110亿美元是绿茶[14]。越来越多的证据表明，绿茶及其成分对健康有各种潜在的益处，近年来，以胶囊和片剂形式的各种即饮绿茶饮料和食品补充产品进入市场，更多地接触到传统酿造绿茶的消费。绿茶对人体健康的益处集中在建立绿茶和/或其生物活性成分的饮食指导，虽然多酚类化合物广泛存在于许多食物和饮料中，包括水果、蔬菜、茶和葡萄酒，但是EGCG在绿茶中的含量远高于其他食物，是绿茶中最有代表性的化合物。

本实验采用高脂饲料喂食大鼠复制高脂血症模型，给予EGCG治疗后，大鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显降低，证明EGCG具有良好的降低TC、TG的作用，对于高脂血症大鼠血清LDL-C 升高、HDL-C降低的脂质代谢紊乱，具有明显的改善作用，可以显著改善高脂饮食大鼠体内的血脂增高现象。本研究为临床治疗高脂血症所需的新的药物或其类似物的发现提供了实验依据。