金黄色葡萄球菌肠毒素C及其突变体在抗肿瘤和骨科治疗中的应用进展

陈欣林，施明杰，林泽桁，张玉明，石 明※

(1.广东医科大学公共卫生学院，东莞市环境医学重点实验室，广东 东莞 523808； 2.南方医科大学南方医院小儿科，广州 510515)

超抗原是在极低浓度下可非特异地刺激多数T细胞克隆活化增殖，产生极强免疫应答的一种蛋白分子，主要由细菌外毒素或逆转录病毒产物组成[1]。超抗原可分为外源性超抗原[如金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)、链球菌致热外毒素、M蛋白等]和内源性超抗原(如小鼠乳腺瘤病毒)。金黄色葡萄球菌肠毒素C(Staphylococcalenterotoxins C，SEC)是由金黄色葡萄球菌产生的外源性超抗原，具有强大的T细胞活化能力。金黄色葡萄球菌是一种多功能病原体，可产生一系列对人类和动物具有毒理作用的外蛋白，如透明质酸酶、葡萄球菌激酶、核酸酶、脂肪酶、蛋白酶、胶原酶、溶血素、剥脱性毒素和含有毒性的超抗原蛋白。其中，超抗原蛋白包括中毒性休克综合征毒素1、葡萄球菌肠毒素样蛋白和SEs。SEC是SEs的一种血清型，能高效活化大量T细胞，并产生多种细胞因子，参与免疫应答。现就SEC的生物学活性及其在抗肿瘤和骨科相关疾病的临床应用及SEC突变体蛋白的研究进展予以综述。

1 SEC的概述

若新发现SEs与先前已知SEs具有≥90%的同源性，则会被指定为先前SEs的亚型[2-3]。SEC是经典肠毒素之一，分子量为27 000～27 600，有SEC1、SEC2、SEC3三种亚型[4]。此外，SEs亚型的其他名称可以指代“变体”而不是指定的数字，如从由绵羊、山羊或牛来源的乳腺炎病例分离的金黄色葡萄球菌菌株产生的SEC变体的情况，命名为绵羊SEC、山羊SEC和牛SEC，显示出独特的宿主特异性[5]。

SEC1、SEC2和SEC3是6种SEC亚型中的成熟毒素，具有高度同源性，同时也是SEC研究的焦点。SEC2和SEC3仅相差4个氨基酸，同源性为98.3%；SEC1和SEC2相差9个氨基酸，同源性为97.1%；而SEC1与SEC3亦相差9个氨基酸，同源性为96.2%[6-7]。不同毒素的刺激活化能力不同，但所有SEC亚型都会引起淋巴细胞增殖。有研究发现，SEC3在口服和静脉注射的猴子模型中均具有高度催吐毒性，故SEC1和SEC2在免疫治疗方面的应用相对较多[8]。

SEC具有强大的超抗原活性，中国早已生产出金葡素注射液，并应用于临床，其主要成分是SEC、蛋白质、多肽、18种氨基酸和游离凝固酶。超抗原依赖性细胞介导的细胞毒性是SEC发挥抗肿瘤作用的主要机制[9]。此外，活化的T细胞可分泌多种细胞因子，包括白细胞介素-2、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、γ干扰素等，进一步激活自然杀伤细胞转化为淋巴因子激活的杀伤细胞，释放蛋白和溶细胞素，诱导细胞死亡，从而杀死对自然杀伤细胞不敏感的肿瘤细胞，抑制肿瘤生长[10-11]。另有研究表明，超抗原刺激淋巴细胞可导致T细胞依赖性B细胞的分化[12-13]。SEC2通过Toll样受体-核因子κB信号通路刺激骨髓来源的树突状细胞的成熟，从而影响抗原呈递细胞，增强免疫效应[14]。此外，超抗原SEC还可通过刺激主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)类分子非依赖性途径引起T细胞扩增，从而加强免疫杀伤作用[15]。

在经典作用模式中，超抗原活化T细胞不需要抗原呈递细胞的加工处理，以完整的蛋白质形式呈递给T细胞，一端在抗原肽结合槽外，直接与抗原呈递细胞膜上的MHCⅡ类分子的α/β链的非多态区外侧结合；另一端直接与T细胞受体复合物(T-cell receptor complex，TCR)的Vβ链的C区结合，形成MHCⅡ-超抗原-TCR三元复合物。T细胞的活化过程具有MHCⅡ分子依赖性，SEC与抗原呈递细胞上的MHCⅡ分子上α/β链的非多态区外侧的特殊位点架桥连接，分别位于α链的低亲和力结合位点和β链的锌配位高亲和力结合位点[16-17]。研究表明，MHCⅡ分子在β1结构域、α1结构域和α2结构域上具有主要结合位点[18]。

SEC还可以通过MHC分子非依赖性T细胞激活途径，使T细胞扩增和产生细胞毒性T淋巴细胞[19]。对MHCⅡ分子缺陷人类细胞的研究发现，超级抗原SEC1支持纯化的人T细胞增殖；SEC2在缺陷细胞存在下抑制SEC1介导的T细胞活化，表明SEC2可与SEC1竞争结合TCR。SEC1的N端附近的特定氨基酸(如L20T和E22G)在促进Ⅱ类非依赖性TCR相互作用中起关键作用，即使MHCⅡ阳性抗原呈递细胞存在时，也不影响活化T细胞的效果。TCR结合亲和力或SEC1-TCR相互作用的拓扑结构的细微差异可以补偿MHCⅡ类分子的缺乏，并促进T细胞增殖[15]。

2 SEC的临床应用

2.1SEC抗肿瘤的临床应用 SEC的临床应用经验主要来自中国卫生部批准的国家一类生物制品金葡素注射液。金葡素注射液主要用于癌症和骨科疾病的临床治疗。SEC可以优先对MHCⅡ阳性的肿瘤细胞产生强烈的T细胞介导的细胞毒性，从而抑制肿瘤生长[20]。金葡素注射液常用于治疗恶性胸腔积液和腹水[21-22]。恶性胸腔积液是多种恶性肿瘤(如乳腺癌，肺癌、非小细胞癌等)中晚期常见的并发症，病死率较高，患者出现循环障碍和呼吸困难的可能性增加，严重者危及生命。金葡素注射液常联合顺铂、奈达铂等药物治疗恶性胸腔积液，患者可耐受、毒副作用小，治疗效果较好。金葡素注射液还可增加因放疗、化疗而减少的白细胞，提高患者生存质量和化疗的耐受性[23-24]。此外，金葡素注射液也可用于直接治疗肿瘤，如微波凝固治疗后，在超声引导下将金葡素注射液注射到肝内肝癌组织中。肿瘤部位的免疫组织化学染色显示，金葡素注射液治疗可显著增加抗肿瘤相关免疫细胞的数量，并改善局部免疫反应[25]。金葡素注射液还可用于治疗气胸[26]，乳糜胸[27]，胸瘘[28]，腹瘘和皮下积液等疾病[29]。金葡素注射液抗肿瘤效果显著，出现发热、腹泻等毒性作用轻微，尚未见严重不良反应发生。

2.2SEC骨科治疗的临床应用 金葡素注射液也用于骨科疾病的治疗。金葡素注射液可全身应用，并可局部注射于骨折断端或骨不连接处，促进骨折愈合[30]。金葡素注射液用于骨缺损、骨坏死等疾病时，也表现出良好的效果[26-27]。以纤维蛋白胶为载体修复骨缺损模型的细胞水平研究发现，金葡素注射液可修复骨缺损，避免金葡素注射液的局部注射缺陷，提高药物疗效[31]。金葡素注射液主要通过改善骨折断端局部血供、促进成骨细胞分化成熟等途径加快骨代谢，促进断骨愈合。可见，金葡素注射液的骨科应用具有巨大潜力，但其机制还需进一步研究探索。

3 SEC突变体蛋白的研究进展

金葡素注射液已在中国用于癌症临床治疗20余年，SEC2是金葡素注射液的主要作用成分。金葡素注射液中SEC2的高分子量导致其通过生物屏障的渗透性差，且存在一定的毒副作用(如发热、局部红肿和胃肠道反应等)，限制了其广泛应用。此外，金葡素注射液的复杂成分也是重要的限制因素，主要效应物质SEC2在注射产品中的浓度非常低，占注射产品总蛋白质的比例<0.1%，故应对注射制剂进行优化改良[32]。近年来，为增强其超抗原特性，减少毒副作用，扩大SEC2的临床应用范围，已陆续出现了许多SEC2蛋白突变体。

SEC突变体研究早期，Wang等[33]通过删除SEC2分子中N端或C端的氨基酸残基(不影响超抗原活性)的方法，构建用于免疫疗法的低分子量超抗原剂(即一系列SEC2突变体)，以探求SEC2的生物活性结构区域，实验表明，缺失N端11个残基的突变体对T细胞刺激活性没有影响，且N端的进一步缺失可严重抑制T细胞增殖的能力，可见，N端是T细胞增殖所必需的；而C端缺失77个氨基酸残基的突变体保留了SEC2超抗原活性，更多C端氨基酸的去除则会降低SEC2的超抗原活性和致热活性，该实验大致确定了SEC2的生物活性结构区域，对相关后续研究具有指导意义。

在构建SEC2突变体蛋白过程中，通过定点突变改变蛋白分子中与毒性相关的活性部位的氨基酸组成，可降低毒性、保留或提高其超抗原活性，已成为目前SEC突变体研究的热点，且选择突变位点尤其重要。研究表明，丙氨酸或丝氨酸取代第93位半胱氨酸和第110位半胱氨酸的定点诱变可干扰二硫键的形成，所形成的突变体可诱导T细胞增殖，并降低肿瘤细胞的细胞毒性作用，由此可见，二硫环结构对维持SEC2的最大超抗原活性有重要作用[34]。第93位半胱氨酸、第110位半胱氨酸和第118位的组氨酸残基是负责呕吐的功能位点。若以这3个功能位点作为取代位点，则可能使新SEC2突变体的催吐活性失活，为临床肿瘤治疗提供新的SEC2突变体免疫治疗剂[35]。SEC2晶体结构有2个锌结合位点，由位于第47位、第118位和第122位的组氨酸残基介导位点形成，锌结合可能对SEC2的生物活性起作用[36-37]。另有研究发现，SEC2中的第47位的组氨酸残基参与MHCⅡ分子结合，对抗原活性起重要作用，但对毒性作用影响甚小，突变体取代第47位的组氨酸残基可对T细胞的增殖能力造成损害[38-39]。同时，锌配位的第118位氨酸残基和第122组氨酸残基与抗原活性无关，在SEC2的催吐和发热中起关键作用。由此可见，突变体可将SEC2的超抗原特性和毒性分离，既可降低毒性，也可保持或提高超抗原特性，且不会造成冲突，为SEC2突变体的开发提供了新思路[38]。

3.1SEC突变体蛋白的抗肿瘤研究进展 近年来，SEC抗肿瘤的临床治疗效果显著，其抗肿瘤的作用成为研究的重点，现已出现的突变体蛋白，在结构和功能上均有差别。通过定点突变SEC2中第20位苏氨酸和第22位甘氨酸而获得的SEC2(T20L/G22E)突变体，与野生型SEC2相比，其超抗原活性和肿瘤细胞的生长抑制活性均得到增强；体内进一步的毒性实验表明，与SEC2相比，SEC2(T20L/G22E)的催吐和热原活性无显著增强[40]。引入丙氨酸取代SEC2分子中第144位苯丙氨酸和第45位亮氨酸所构建的mSEC2(F44A，L45A)突变体，具有与SEC2相当的刺激淋巴细胞增殖并抑制肿瘤细胞的能力，但能显著减弱致热毒性[41]。

Zhang等[42]运用重叠聚合酶链反应将天然SEC2的第102～106位(即GKVTG)氨基酸残基换为WWH、WWT和WWP(SEC3突变体第102～104位氨基酸残基的名称，WWH对应SEC3 1A4、WWT对应SEC3 1D1、WWP对应SEC3 1D3)，并将3种突变体分别命名为ST-1、ST-2和ST-3。与天然SEC2相比，以上3种突变体可改善小鼠淋巴细胞增殖，抑制肿瘤细胞生长；ST-1和ST-3的发热活性与天然SEC2相当，但ST-2的发热活性较天然SEC2显著增强。Zhang等[43]将SEC2的第102～106位残基用WWH代替为WWD，命名为ST-4(GKVTG102-106WWH)。与野生型SEC2相比，ST-4可以激活更多的TCR-Vβ8.2和TCR-Vβ8.3T细胞和自然杀伤细胞，这些活化细胞增加释放颗粒酶B和穿孔素，通过线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡增强。有研究指出，SEC2/ST-4可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和核因子κB信号通路参与T细胞活化，ST-4增强磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和核因子κB信号转导，最终导致T细胞活化增强[44]。

与野生型SEC2(rSEC2)相比，突变体SAM-3(T20L/G22E/H118A/H122A)增加了TCR结合亲和力，有助于大量T细胞活化和细胞因子的释放[45]。SAM-3还可以激活人TCR-Vβ12、3a、14、15、17和20的CD8+T细胞，以增强免疫应答。此外，活化T细胞分泌的肿瘤坏死因子-α可诱导肿瘤细胞凋亡和G1期阻滞，对HepG2肿瘤细胞产生杀伤作用。T细胞可通过多种途径诱导肿瘤，SAM-3可通过T细胞上调肿瘤坏死因子受体1信使RNA的表达以及胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的活性，介导肿瘤细胞凋亡[46]。

对各种突变体的分析和比较，有利于拓宽新药物SEC的研发思路，也可从中尽可能找出最合理优化的突变体，进行下一步临床试验，加快临床药物的研发进程。

3.2SEC突变体蛋白的骨科研究进展 SEC虽已应用于临床治疗骨折等骨科疾病，但效果有待提高，且其作用机制仍在探索中。近年来，有学者对突变体2M-118(H118A/T20L/G22E)的骨科应用展开研究。SEC2中第118位组氨酸被丙氨酸取代，第20位苏氨酸被亮氨酸取代，第22位甘氨酸被谷氨酰胺取代，得到2M-118突变体。在人间充质干细胞上，2M-118可通过上调骨形成蛋白2和Runt相关转录因子2/核心结合因子α1的表达，显著改善成骨细胞分化，干扰素诱导的基因IFI16也可在成骨细胞分化中被2M-118激活；2M-118还可通过上调骨保护素的表达和抑制核因子κB受体活化因子配体的表达，使骨保护素/抑制核因子κB受体活化因子配体的比值升高，从而抑制人间充质干细胞中破骨细胞的生成，促进骨再生[47]。

对大鼠骨髓间充质干细胞的体外研究发现，与磷酸缓冲盐溶液相比，2M-118可促进成骨分化并增强矿化，且碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白等骨标志物基因显著上调，且对大鼠体内牵张成骨模型的研究发现，2M-118治疗组骨体的骨体积分数明显升高，新骨形成和巩固明显加快，胫骨的机械性能增加，促进牵张成骨和增强骨固结[48]。对大鼠股骨骨折模型的研究发现，与磷酸缓冲盐溶液相比，局部使用2M-118可通过增加骨折愈合组织体积、上调骨体积分数和促进生物力学恢复来加速骨折愈合，与磷酸缓冲盐溶液相比，2M-118治疗组具有更好的组织学外观[49]。综上所述，2M-118突变体可通过抑制破骨细胞形成加快钙沉积，从而加快成骨并增强骨固结，促进骨折愈合。2M-118突变体可成为促进骨修复的潜在治疗剂，应用于临床骨科疾病治疗。但仍需要进一步的研究以了解2M-118突变体促进骨生成和骨折愈合的机制，进一步在临床研究中验证在人体中的作用。

前交叉韧带损伤难以治愈，关节镜下自体腘绳肌腱移植重建是治疗前交叉韧带损伤的主要方法，促进术后肌腱与骨隧道的良好愈合尤为重要。对兔膝关节建立前交叉韧带重建模型的研究发现，局部注射SEC可启动局部无菌性炎症反应，加快腱骨界面血管生成、激活骨细胞和纤维细胞大量增殖，有效促进前交叉韧带重建后移植肌腱与骨隧道的愈合，为加快前交叉韧带术后愈合提供了新方法[50]。

3.3SEC突变蛋的其他应用及研究进展 随着研究的进展，SEC突变体在其他方面的应用逐渐被发现。恶性肿瘤患者并发致命性血栓栓塞性疾病十分常见，临床上将恶性肿瘤相关性血栓称为Trousseau综合征。目前尚无有效方法或适当药物预防和治愈肿瘤血栓栓塞，为了预防和治疗肿瘤，采取有效措施或寻找合适的药物十分重要。有学者提出，可利用超抗原的抗肿瘤特性和葡激酶(staphylokinase，Sak)的血栓溶解活性将两者结合起来，共同用于治疗肿瘤血栓。Hui等[51]通过9-丙氨酸-连接器将SEC2和Sak基因连接，成功构建Sak-连接器-SEC2和SEC2-连接器-Sak，两种嵌合蛋白都具有与SEC2几乎相同的外周血单个核细胞增殖刺激活性、抗肿瘤活性以及与Sak样的血栓溶解活性。但由于SEC2的固有催吐活性和嵌合蛋白的高分子量(重均分子量为44 000)，这种嵌合蛋白仍需进一步优化。Hui等[52]构建了较Sak-连接器-SEC2和SEC2-连接器-Sak分子量更低、无催吐反应、无多聚组氨酸标签和无连接器的截短双功能嵌合蛋白(ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2)，与前者相比，这种截短的蛋白质保留了几乎相同的抗肿瘤和溶栓活性，但分子量更小，重均分子量仅为29 000，其免疫反应性略低于ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2。为了增加肿瘤治疗的特异性和靶向性，现将肿瘤靶向肽-奥曲肽与双功能嵌合蛋白结合形成新的融合蛋白pET-28a-ΔSEC2-ΔSak和pET-28a-ΔSak-ΔSEC2，此种融合蛋白可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，明显抑制人胃癌细胞的生长，还具有溶栓活性，表明融合蛋白可以特异性靶向肿瘤表面，对肿瘤的靶向治疗及溶栓治疗具有重要意义[53]。

为了增加患者依从性和减少毒副作用，虽SEC2作为静脉内蛋白质药物，学者们也对其口服给药途径展开研究。用His标记的SEC2(SEC2-His)对SEC2作为潜在口服蛋白药物的抗肿瘤活性和毒性的研究发现，高剂量口服给药不会导致显著毒性，且SEC2-His可以免疫整合形式穿过肠上皮，维持抗肿瘤活性，但具有更低的全身毒性[54]。此外，狂犬病是人畜共患病，死亡率近100%，最新研究表明，疫苗联合SEC2免疫的小鼠产生了更具特异性的抗狂犬病抗体，促进狂犬病疫苗诱导的特异性免疫应答，SEC2可作为狂犬病疫苗的佐剂，对预防狂犬病具有重大意义[55]。既往有关SEC2的研究都集中在T细胞激活的特征，但SEC2也可以通过Toll样受体-核因子κB信号转导途径刺激小鼠骨髓来源的专业抗原呈递细胞-树突状细胞成熟，以增强免疫应答[14]。

4 小 结

超抗原SEC，特别是SEC2，具有非常强大的免疫调节作用，应用领域逐渐多样化，如抗肿瘤治疗、骨科疾病、溶栓、疫苗佐剂等。SEC的研究价值日益提高，尽管还存在胃肠道反应和致热等毒副作用，但随着先进的分子生物学和相关技术的快速发展，许多SEC2突变体的成功构建有利于更优质候选药物的筛选，并通过改善SEC效果和减少不良反应，生产出更安全、高效、无毒副作用的生物制剂，扩展SEC的临床应用范围。