Klotho抑制肾间质纤维化的作用及机制

缪静龙，刘其锋

(江苏大学附属昆山医院肾脏内科，江苏 昆山215300)

Klotho是1997年发现的一个新基因，Klotho基因表达缺失的小鼠表现出类似人类衰老的症状及体征，因而是一种抗衰老基因[1]。Klotho基因位于第13号染色体(13q12)上，根据其基因结构的不同，可表达膜型及可溶性两种Klotho蛋白；膜型Klotho是定位于细胞膜的单链跨膜蛋白，由全部Klotho基因编码生成，但其胞外区可以被水解脱落生成可溶性Klotho，可溶性Klotho也可来源于Klotho信使RNA的可变修饰生成[2]。膜型Klotho和可溶性Klotho的表达密切相关，膜型Klotho的减少会导致可溶性Klotho的同步减少；两者功能类似，但又有所区别：膜型Klotho主要作为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)23的协同受体，与FGF-23形成复合物后参与机体钙磷代谢的调节；而可溶性Klotho可以随血液、体液等全身播撒，作用于相应的靶器官发挥一定的生物学等作用[3-4]。随着对Klotho生物学认识的不断深入，发现其功能早已超越了“抗衰老”的范畴(如抗氧化、抗炎、调节钙磷代谢、抑制血管钙化、抑制细胞凋亡及组织器官纤维化等)，而Klotho对纤维化的抑制作用尤其值得关注[5]。研究证实，Klotho主要表达于肾脏，Klotho的表达异常也与慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)相关的肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)发生发展相关，被认为是肾脏纤维化的标志物之一[6]。现就Klotho抑制RIF的作用及机制进行综述。

1 Klotho抑制RIF的作用及机制

Klotho的肾脏保护效应是多因素的，其中对RIF的抑制是Klotho发挥肾脏保护作用的一个重要方面[7]。RIF是CKD最主要的病理特征，也是多种肾脏疾病进展至终末期肾病的最终通路。RIF与肾功能密切相关，抑制RIF也是CKD防治的重要干预靶点。有研究表明，肾组织Klotho表达量与RIF及肾小球硬化程度负相关，而给予外源性可溶性Klotho可减轻RIF程度，改善肾功能，证实了Klotho对RIF的抑制作用[6,8]。证据显示，Klotho可以调控体内多条致纤维化信号通路，如转化生长因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、Wnt/β-联蛋白(β-catenin)、肾小管上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)、FGF-2、内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)等多条纤维化相关信号通路，从而多靶点抑制RIF的发生发展[7]。

1.1抑制TGF-β1信号通路 TGF-β1及其下游Smads蛋白是经典的致纤维化通路，TGF-β1与其受体结合后，通过调控Smads蛋白的磷酸化而激活致纤维化基因的转录，其中Smad2/3起正调控作用，Smad7通过竞争性结合TGF-β1的受体阻断Smad2/3的磷酸化，负向调控TGF-β1的作用。一项关于糖尿病肾病患者的调查表明，血清可溶性Klotho水平随着蛋白尿的增加逐渐下降，而血清TGF-β1的水平逐渐升高，两者呈显著负相关[9]，提示Klotho的减少可能与TGF-β1信号的激活有关。在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾脏纤维化模型中发现，Klotho基因缺陷会加重TGF-β1诱导的RIF的形成，而野生型小鼠或给予外源性可溶性Klotho治疗则抑制了TGF-β1导致的RIF[10]。近期的研究也发现，Klotho基因剔除会导致TGF-β1及其下游信号的激活，加重UUO诱导的RIF[11]。在糖尿病肾病模型中，Klotho缺失在不影响肾脏血流的情况下，促进了肾小球的肥大及系膜基质的增生，上调了TGF-β1及磷酸化Smad2的表达，而Klotho表达增加则可逆转以上改变[12]。体外实验表明，Klotho抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell，RTC)内TGF-β1的活性，并降低TGF-β1的Ⅱ型受体含量，减少纤维化标志物的产生[13]。综上，证实了Klotho对TGF-β1及其下游纤维化信号的抑制作用。在Klotho抑制TGF-β1信号的机制研究中，Doi等[14]发现，可溶性Klotho与TGF-β1的Ⅱ型受体有较高的亲和力，可溶性Klotho与TGF-β1的Ⅱ型受体结合后影响了与TGF-β1的结合，干扰了TGF-β1和Smad信号转导，类似于Smad7转录抑制作用，这可能是Klotho抑制TGF-β1信号的机制，但这种结合是竞争性的或是由变构效应导致的尚不明确。

1.2干扰Wnt/β-catenin信号通路 经典Wnt信号的激活也与器官纤维化包括肾脏纤维化的发生发展相关[15]。Wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白，共有19种，是Wnt/β-catenin信号通路的起始蛋白。正常细胞内β-catenin与其他物质形成复合物，导致β-catenin 的磷酸化而被蛋白酶降解，使胞内游离的β-catenin处于低水平状态；当Wnt信号激活后抑制了β-catenin磷酸化，导致胞内游离的β-catenin增多而移位，致细胞核与核内转录因子结合，调控下游多种与纤维化有关的基因转录(fibronectin、基质金属蛋白酶7、Twist及Snail等)[16]。在衰老的小鼠模型中发现，Klotho缺失引起Wnt信号的激活并触发了细胞老化，说明Klotho对Wnt信号通路具有调节作用[17]。在UUO模型中也发现，Wnt信号的多种成分(如Wnts、β-catenin、fibronectin)的表达在RIF中明显上调，而Klotho转基因小鼠RIF减轻，同时Wnts、β-catenin、fibronectin的表达也明显减少[18]。体外实验也证实，可溶性Klotho对心肌细胞和RTC细胞的Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用[18-19]。在阿霉素诱导的肾损伤模型中，随着肾损伤时间的延长，肾组织可溶性Klotho的表达强度逐渐减少，而β-catenin 的强度却逐渐增多，且两者呈负相关；进一步分析发现，可溶性Klotho一方面能与免疫标记的Wnt1、Wnt4或Wnt7a等结合形成复合物；另一方面Klotho也直接抑制了β-catenin的核内移位[20]，说明Klotho通过干扰Wnt和β-catenin的作用使经典的Wnts/β-catenin致纤维化通路失活。

1.3抑制肾脏EMT EMT是指上皮细胞失去原有的细胞表型，而获得间充质细胞表型的过程，发生EMT的细胞结构与功能发生改变，在肿瘤转移及纤维化形成中发挥重要作用[21]。RIF伴随大量肌纤维母细胞的激活，继而产生大量细胞外基质，促进RIF发生发展。有研究表明，RTC经EMT途径可以产生RIF所需的大约36%的肌纤维母细胞[22]。虽然近年来对EMT在器官纤维化中的作用有争议，但并不能完全否认EMT的作用[23]。在经典的UUO模型中，Klotho基因缺失可以上调肾组织肌纤维母细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，同时下调上皮性标志物上皮钙黏素(E-cadherin)的表达，减轻RIF[10]。EMT的激活及Klotho的减少也是环孢素A(cyclosporine A，CsA)肾毒性的一个重要发病机制。近期的研究显示，CsA引起了肾组织EMT标志物的改变，外源性可溶性Klotho治疗缓解了CsA诱导的肾组织EMT过程，抑制了CsA相关的RIF[24]。体外实验表明，可溶性Klotho可以使FGF-2刺激的人肾皮质近曲小管上皮细胞2(human kidney-2 cell， HK-2)细胞形态向上皮样细胞转变，并上调HK-2细胞E-cadherin的表达，抑制α-SMA的表达[25]，这表明可溶性Klotho抑制了FGF-2诱导的EMT。来自Klotho基因变异小鼠的RTC体外分离培养也发现，Klotho缺失增强了TGF-β1诱导的EMT改变[26]。通过药物间接增加肾脏Klotho的合成，显著抑制肾脏α-SMA的表达，上调了E-cadherin的表达，进一步验证了Klotho对EMT的抑制作用[27]。Klotho抑制EMT的机制尚不明确。TGF-β1是引起EMT过程的主要细胞因子，而Snail则是调控EMT的主要转录因子，同时又是Wnt/β-catenin的主要下游靶基因，因此，Klotho对EMT的影响可能是通过间接调控TGF-β1和Wnt/β-catenin通路实现的。

1.4调控RAS RAS的激活在CKD发病及进展中的作用已经取得共识，对RAS的抑制是延缓CKD进展的一个主要干预靶点。RAS的激活、Klotho降低以及FGF-23水平的升高是CKD患者的共有特征，它们之间存在复杂的交叉对话，RAS的激活降低了Klotho的表达，而Klotho也调控了RAS的活性，协同参与了CKD的进展[28]。在5/6肾切除模型、UUO及阿霉素肾病模型中均发现，模型组动物肾组织Klotho的表达显著降低，而RAS的多种成分(如肾素、血管紧张素转换酶)的表达显著提高，Klotho基因转染则抑制了上述物质及纤维化因子TGF-β1、α-SMA的表达，改善了肾脏病变；体外实验也表明，可溶性Klotho能剂量依赖性地抑制RTC细胞内肾素、血管紧张素转换酶及纤维化因子的表达[29]。在另一个阿霉素肾病模型中发现，模型组动物血清及肾组织中肾素、血管紧张素Ⅱ表达上调，Klotho表达下降，而外源性可溶性Klotho治疗则减少了肾素、血管紧张素Ⅱ的表达，缓解了RIF；而在Klotho抑制RAS的机制研究中发现，若同时应用Wnt/β-catenin抑制剂则阻断了Klotho对RAS的抑制作用，说明Klotho对RAS的调控可能部分依赖于Wnt/β-catenin的作用[30]。已有研究表明，所有RAS成分基因的启动子区域均含有β-catenin的结合位点，因此，Wnt/β-catenin 作为RAS上游调控因子调控了RAS的表达[31]，Klotho对RAS的抑制可能与Wnt/β-catenin有关。

1.5抑制FGF-2信号通路 FGF-2也是一个促纤维化因子，参与了肝脏、心肌及肺组织的纤维化的过程，也与肾脏纤维化的发生发展有关[32]。研究表明，FGF-2及其受体在RIF中的表达显著上调，且与RIF的程度密切相关[33]。FGF-2与其肾组织FGF-2的1型受体结合后，导致下游胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2的磷酸化而激活下游靶基因的转录；可溶性Klotho可以抑制肿瘤细胞内FGF-2水平及下游ERK1/2的激活，抑制肿瘤的增生及转移，说明Klotho对FGF-2信号具有调控作用[34]。体内研究表明，外源性可溶性Klotho治疗降低了UUO模型中FGF-2的水平，同时抑制了ERK1/2的激活及肌纤维母细胞的激活，减轻了RIF；体外实验也进一步证实，一方面可溶性Klotho可以剂量依赖性地降低FGF-2诱导的HK-2细胞ERK1/2的磷酸化，同时竞争性地与FGF-2的1型受体结合；另一方面FGF-2可以使培养的HK-2细胞形态发生改变，同时上皮性标志物E-cadherin表达减少，肌纤维母细胞标志物α-SMA表达增多，而可溶性Klotho干预后FGF-2及ERK1/2的磷酸化水平均降低，并逆转了HK-2细胞形态改变以及E-cadherin 和α-SMA的表达，说明可溶性Klotho对FGF-2信号的抑制也影响了肾脏EMT过程[25]。目前已知，Klotho是FGF因子的协同受体，可与FGF受体结合形成复合物。Klotho与FGF-23受体结合后可以促进FGF-23的结合，发挥钙磷调节的作用，但与FGF-2受体结合后干扰了FGF-2与其受体的结合[35]，从而抑制了FGF-2介导的致纤维化过程。

1.6抑制ERS ERS是新发现的与器官纤维化有关的通路。研究表明，UUO诱导的RIF伴随ERS标志物的大量表达，表明ERS被激活，而抑制ERS能缓解UUO诱导的RIF[36]，说明ERS也是RIF发生的一个促进因素[37-38]。缺氧及氧化应激等是ERS的常见激活诱因，而Klotho具有抗氧化作用，推测Klotho可能对ERS具有调节作用。来自冠心病患者的心肌活检显示，心肌细胞Klotho的表达明显减少，而ERS标志物葡萄糖调节蛋白78的表达显著增多，说明Klotho的减少可能与ERS的激活有关[39]。Song等[40]发现，异丙肾上腺素可以诱导心肌细胞大量活性氧的产生，并上调ERS标志物[如葡萄糖调节蛋白78、热激蛋白47及C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)]的表达，而可溶性Klotho干预后则减少了活性氧类的产生，抑制ERS标志物的表达，缓解了ERS相关的心肌肥厚。体外实验也表明，可溶性Klotho缓解了药物诱导的HK-2细胞ERS反应，减轻活性氧类导致的HK-2损伤，而Klotho基因剔除则阻断了这种保护效应[41]。进一步的研究也证实，UUO引起的RIF伴随肾组织ERS标志物葡萄糖调节蛋白等的增多，而可溶性Klotho替代治疗下调了这些标志物的含量，抑制了ERS，并减轻了RIF[42]。因此，可溶性Klotho对ERS具有调节作用，调控ERS的机制可能与其对氧化应激的调控有关，但具体机制尚不明确。

总之，RIF发生机制复杂，多条致纤维化通路之间也存在复杂的交叉对话，而Klotho抗RIF的作用也是多靶点的。除了以上机制以外，Klotho能否调控其他与纤维化有关的通路(如哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白、胰岛素样生长因子1、Toll样受体等信号通路)，还需要在以后的研究中进一步阐明。

2 Klotho的应用价值

RIF是CKD进展至终末期肾病的最终通路，而Klotho表现出明显的RIF抑制作用，这为CKD相关RIF的防治提供了新方向，值得关注。目前已知，CKD伴随Klotho的明显减少，而Klotho的减少反过来又加重了RIF的程度，促进了CKD的进展。因此，调控体内Klotho的表达，理论上具有抑制RIF防治CKD的作用。通过基因工程手段导入Klotho的基因序列是提高Klotho水平的理想调控手段，但目前只限于基础研究；而直接给予外源性Klotho替代治疗，是发挥Klotho抑制RIF的最直接手段，这在多种动物实验中已经得到证实[19, 24, 42]。而通过药物间接调控体内Klotho的表达，也是发挥Klotho作用的一个新方法。我国传统中药单体(如姜黄素和大黄酸)，被证实可以上调Klotho的表达水平，缓解了CsA或UUO诱导的RIF[43-44]。RAS抑制剂缬沙坦也被证实可上调糖尿病患者血清可溶性Klotho浓度，而可溶性Klotho水平的上升伴随白蛋白尿的减少及糖尿病肾病进展的延缓[45]。抗氧化剂也被发现能剂量依赖性地升高CsA肾毒性动物模型中肾组织Klotho的表达，缓解 RIF[46]。综上，说明通过多种手段，直接或间接增加Klotho的表达，确实能减轻RIF，这对RIF的防治而言意义重大，具有临床应用价值。

3 小 结

RIF的发生发展涉及多种细胞因子、信号通路的作用，因而其防治也是多靶点、综合治疗的过程。作为重要的肾脏保护因子，Klotho显示出了调控多种信号通路的致纤维化效应，通过多靶点的作用最终发挥RIF的抑制功能，是一个很有发展前途的抗RIF因子。然而，CKD被认为是肾脏保护因子Klotho的缺乏状态，而Klotho的缺乏可能进一步加剧RIF，长远来看，也增加了肾功能恶化的风险，这在近期的前瞻性研究中已被证实[47-48]。因此，将来如何以Klotho为设计靶点，调控Klotho的表达，进而充分发挥Klotho的抗纤维化作用，对RIF的防治而言可能是一个新的干预策略，值得进一步研究。