微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

王宏润，李宏宇

(1.右江民族医学院，广西 百色 533000； 2.广西壮族自治区人民医院骨科，南宁 530021)

间充质干细胞具有来源方便，易分离、培养扩增、纯化及多向分化和增殖能力，其可在适宜的体外环境多向分化，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肝细胞等分化的特性，这使其在重建退化组织及相关骨疾病的临床应用中具有广阔的前景[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是由19～25个核苷酸组成的非编码小分子RNA，其主要参与了细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动，广泛存在于各个生物群体中，miRNA的分子结构包括非编码区(untrans-lated region，UTR)及内含子间隔开的编码区。大量研究表明，miRNA在生物细胞的增殖、分化，病毒感染及肿瘤细胞增殖过程中起关键作用[2-4]。miRNA的产生是由RNA聚合酶Ⅱ与DNA生成初级转录物(pri-miRNA)，pri-miRNA典型的茎环结构经过核糖核酸酶Ⅲ内切酶加工后由转运蛋白运送到细胞质，生成具有茎环结构的前体miRNA，前体miRNA在细胞质中核酸酶与RNA解旋酶的作用下生成miRNA[5]。miRNA的作用之一为通过与信使RNA编码区及UTR的不完全互补配对，在后续的细胞生长及发育过程中起重要作用。而miRNA的另一作用为通过与靶基因3′UTR非完全配对抑制靶基因翻译。此外，在成骨过程中miRNA也发挥了重要作用。现就miRNA调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的研究进展予以综述。

1 miRNA在成骨分化过程的作用

miRNA可调控不同细胞的成骨分化[6]，但目前对miRNA中特异性作用于BMSC成骨分化的基因家族研究较少。近年来，miRNA的修饰功能在间充质干细胞调控成骨分化中起关键作用[7]。miRNA通过调控相关转录因子的表达影响成骨分化过程，不同转录因子作用于间充质干细胞，使其分化为成骨细胞[Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、锌指结构转录因子Osterix、β联蛋白(β-catenin)、活化转录因子4、Smads、Satb2等]与破骨细胞 (转录因子c-Fos、Pu．1、核因子κB、活化T细胞核因子c1等)[8-11]。研究表明，miRNA不仅具有促进成骨分化的作用，也有抑制成骨分化的作用，如miR-26a可以通过成骨分化的经典通路[骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-Smads通路]增加人脂肪来源干细胞基因的表达，从而促进成骨分化[12]；miR-125b通过对目标靶基因Cbfβ进行调控，减少成骨标志基因的表达，从而抑制成骨分化[13]。目前研究已经发现了大量miRNA在成骨分化过程中的作用，但其具体机制尚不明确。

2 与BMSC成骨分化相关的信号通路

BMSC具有较高的复制能力，在体内或合适的体外环境中通过细胞因子的诱导可使其分化成各种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、基质细胞和造血细胞。BMSC成骨分化过程中的相关信号通路除BMP-Smads信号通路、Wnt/β-catenin信号通路和Notch信号通路3条经典信号通路外，还有促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、核因子κB受体活化因子信号通路等，它们在成骨分化过程也起重要作用。

2.1BMP-Smads信号通路 BMP作为转化生长因子-β超家族成员之一，在成骨分化过程中起关键作用，其不仅在成骨分化中作用突出，也在胚胎发育、细胞增殖及相关肿瘤形成过程中发挥重要作用。BMP-Smads信号通路通过配体BMP与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，促进下游信号蛋白中的丝氨酸或苏氨酸磷酸化，将细胞外的信号传入细胞内，从而发挥多种生物功能[14-16]。Smads作为胞质中的蛋白因子是BMP信号通路中的一个重要因子，其在体内参与相关调节时与其他通路交互作用组成了复杂的调节网络。实验证明，BMP作为最早的骨形态发生信号因子，特异性诱导骨形成及其细胞分化[17]。BMP在细胞外与相应受体(BMP受体Ⅰ和BMP受体Ⅱ)配对后发生磷酸化，BMP受体通过结合丝/苏氨酸激酶受体产生抑制性功能受体，抑制性功能受体在细胞质内与Smads结合后进入细胞核，与smrf1因子结合，其结合产物再通过与活化特异性转录因子(Runx2、Osterix等)特异性结合调节骨代谢，从而诱导间充质干细胞成骨分化过程[18-19]。有研究发现，当激活BMP-Smads通路时，Runx2、Osterix作为主要受调控因子显著上调，从而促进BMSC的成骨分化[9]。

2.2Wnt/β-catenin信号通路 作为成骨分化过程中的又一关键通路，Wnt信号通路参与成骨分化的部分机制已被证实[20]。目前，已发现Wnt信号通路参与了促进骨形成、抑制脂肪形成及肿瘤发生过程等诸多生物学活动[21]。根据有无β-catenin参与，Wnt信号通路分为经典信号通路与非经典信号通路两种，其中Wnt/β-catenin信号通路作为经典传导通路已成为成骨细胞的研究热点。Wnt配体及其相应的受体和细胞内信号分子构成经典的Wnt信号转导途径。Wnt信号转导途径成员主要包括细胞外Wnt蛋白(配体)、卷曲蛋白、β-catenin、T细胞因子/淋巴增强剂等，下游靶基因包括细胞周期蛋白D1、c-myc、Runx2、Osterix等，这些相关基因在成骨分化过程中起重要作用[22]。如Wnt信号通路抑制糖原合成酶激酶3β活性，促使β-catenin进入细胞核，β-catenin在细胞核内启动下游相关因子，相关因子作用于BMSC，促进成骨分化[8,23-24]。近年对Wnt信号转导途径进行研究发现，LRP5的突变可影响骨形成及骨代谢失调，从而影响骨量水平[25]。

2.3Notch信号通路 Notch作为保守的受体蛋白，其引导的信号通路已被证实在许多疾病的发病机制中起重要作用，如急性肝衰竭、银屑病等，且其在成骨细胞分化过程中也是研究热点[26]。Notch同源分子包括4型，即Notch1、2、3、4。而Notch受体蛋白对应的下游配体同源分子目前有5种，分别为Delta1、3、4及Jagged1、2[27-28]。体外研究发现，不同的激活方式使得Notch信号通路发挥了促进成骨与抑制成骨的双向作用，其中Notch受体蛋白通过激活Osterix/Sp7，上调细胞周期蛋白D、E，从而抑制成骨分化；另一方面，Notch受体蛋白通过结合Runx2，使Runx2活性下降，从而抑制成骨分化[29-30]。有学者通过培养能特异性激活Wnt/β-catenin信号通路的小鼠，检测Notch相关配体Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta4及相关骨代谢转化指标(Runx2、成骨分化特异性标志物碱性磷酸酶)发现，Notch相关配体的表达明显增加，且Runx2、碱性磷酸酶的表达水平也明显升高，这表明Wnt/β-catenin信号通路可通过细胞因子刺激Notch信号，从而促进BMSC成骨分化[31]。

3 调控BMSC成骨分化的miRNA

3.1miR-99a 实验发现，在含有miR-99a抑制剂的功能化支架上局部植入BMSC可以增强局部骨的形成，且与多能细胞的C3H10T-1/2相比，miR-99a在成骨细胞MC3T3-E1和MA5-A5中均显著下调[7]。有学者在信使RNA的组蛋白去甲基化酶KDM6B序列3′ UTR上找到了miR-99a对应序列，并分别将野生型和突变型KDM6B 3′UTR插入到pmirGLO荧光素酶载体，再将这些载体转到C3H10T-1/2细胞[32]。结果显示，野生型KDM6B中的miR-99a在低聚核苷酸的作用下，明显抑制了荧光素酶的活性。而突变组逆转了miR-99a的作用，减弱了荧光素酶的抑制作用。这一结果表明，miR-99a可以直接与KDMB6的3′UTR结合，从而在转录后调节蛋白质水平。因此，KDM6B被确定为miR-99a的重要目标之一。此外，HOX基因表达的蛋白质可通过增加Runx2表达促进成骨分化。有学者通过研究HOX基因与成骨分化的关系发现，转染miR-99a可以显著抑制HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表达,而miR-99a抑制剂可以增加HOXC6-1、HOXA10、HOXB2和HOXC10的表达，表明miR-99a通过HOX相关转录因子调控KDM6B[33]。这表明，特异性抑制miR-99a可能是一种新治疗方法，其可用于增强基于BMSCs的成骨分化能力。

3.2miR-26a 通过对不同来源的间充质干细胞进行研究发现，miR-26a调节成骨分化的通路大致包括以下几条：Smad1信号通路、Tob1信号通路、Wnt信号通路、糖原合成酶激酶3β信号通路[34]。在研究人脂肪组织来源间充质干细胞成骨分化的过程中，可以检测到miR-26a高表达，而Smad1蛋白表达下调。Balogh等[35]报道，miR-26a参与了多发性内分泌癌蛋白调控Smad1的细胞表达过程。多发性内分泌癌蛋白作为抑癌基因多发性内分泌腺瘤致病因子1的产物在转录过程中具有广泛作用，有学者在分析人脂肪组织来源间充质干细胞时发现，多发性内分泌癌蛋白及miR-26a两者均上调，且相关成骨标记基因Runx2、骨钙素等也上调[35]。染色质免疫沉淀分析发现，多发性内分泌癌蛋白通过与miR-26a的基因启动子结合来诱导其表达，表明miR-26a在人脂肪组织来源间充质干细胞成骨分化过程中可能起关键作用。另一项研究发现，多发性内分泌癌蛋白作为调控因子，通过miR-26a对Smad1蛋白进行间接调控[36]。因此，miR-26a在成骨分化中扮演的角色及人脂肪组织来源间充质干细胞成骨分化的具体分子机制有待进一步阐明。

3.3miR-21 miR-21通过抑制快速发育生长因子同源蛋白2抗体(Spry2)负反馈调节Runx2与Osterix，继而调节BMSC成骨分化，在这一表达过程中，Runx家族成员之一Runx2起着至关重要的作用。Spry负向调节成纤维细胞生长因子首次在果蝇胚胎分化器官过程中被发现[37]。此外，Spry家族由Spry1、 Spry2、 Spry3 和Spry4四个基因组成，它们在人和大鼠之间均高度保守。在骨质疏松症患者BMSC成骨分化试验中，通过逆转录-聚合酶链反应检测经miR-21转染的人类BMSC发现，Spry1基因的表达下调，Runx2和Osterix过表达，从而导致BMSC的成骨分化增强。杨楠等[38]通过研究人类BMSC中的miR-21/Spry1功能轴发现，过表达miR-21通过抑制目标蛋白Spry1的表达对成骨分化起促进作用；为进一步确定Spry1对成骨分化的抑制作用,他们对培养好的人类BMSC进行miRNA及前体miR-21转染，转染成功后对BMSC进行体外观察及相关指标的检测，结果发现过表达miR-21的碱性磷酸酶活性升高，而抑制miR-21表达，碱性磷酸酶活性明显下降，且miR-21可通过下调Spry1，使成骨特异性基因Runx2和Osterix过表达，从而抑制成骨分化。

3.4miR-145 Sun等[39]通过降低成骨细胞中的miR-145水平，利用蛋白质印迹法和定量逆转录-聚合酶链反应检测Runx2、Osterix、β-catenin、T细胞因子1的表达发现，miR-145水平的下降可以促进Runx2、Osterix、β-catenin、T细胞因子1的表达，从而促进成骨分化，过表达 miR-145通过负调节Osterix的表达抑制成骨分化。临床检测发现，骨发育不全患者中的miR-145表达较正常人减少[40]。而对miR-145成骨分化过程进行动态检测发现，miR-145与叉头框蛋白O1的表达呈负相关，即miR-145上调，叉头框蛋白O1下调[41]。miR-145的结合位点位于叉头框蛋白O1 3′ UTR的770～776碱基，Hao等[42]通过蛋白质印迹法和定量逆转录-聚合酶链反应检测Runx2、Osterix、β-catenin、T细胞因子1的表达及对双荧光素酶进行分析表明，miR-145可直接负调控靶基因叉头框蛋白O1 3′ UTR。

4 成骨分化过程中间充质干细胞与miRNA的关系

间充质干细胞广泛存在于体内的组织细胞中，其定向分化能力是由多因素参与调控，各种细胞因子作用于DNA上，决定间充质干细胞的分化方向。其中，成骨分化与成脂分化作为两个重要的分化方向存在动态平衡，一般抑制成脂分化的miRNA会反向促进成骨分化。因此在基础研究中，应充分考虑miRNA可能的分化方向。miRNA作为细胞表达的重要组成部分，其在转录水平调节蛋白的表达。miRNA作用于间充质干细胞后，调节间充质干细胞分化为不同细胞，其不仅在成骨分化中有重要作用，同时也在肿瘤的发生、组织生长、各个组织器官病变过程中发挥重要作用。在探索miRNA对成骨分化影响的这一过程中，已进行了大量相关实验，包括构建相关干扰载体，获得稳定的细胞株、细胞株培养、细胞转染，定量逆转录-聚合酶链反应检测相关基因的表达，蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达及碱性磷酸酶的检测等。在实验过程中，许多不确定因素会对实验结果产生影响，如实验操作技术、实验中细胞株的选择等均可能造成假阳性结果。目前，已发现一些miRNA在骨质疏松中发挥重要作用，如miR-2861在小鼠实验中被证实是通过组蛋白去乙酰化酶5增加Runx2的表达，从而对成骨分化起正向调节作用[43]。但通过基因手段治疗骨代谢疾病仍需不断探索，与成骨分化相关的miRNA在骨质的新生与改建中发挥着不可忽视的作用，通过对这些相关miRNA进行深入探讨，将有助于更好地了解成骨分化，从而为骨代谢相关疾病的治疗提供理论基础。同时，大量未知miRNA的功能仍需要继续探索，且对于大多数已知的miRNA，其调控机制、下游靶基因的选择、表达时序性及与相关疾病的联系等问题亦需进一步研究。

5 小 结

目前，已知miRNA在调节通路的激活过程中发挥重要作用，这使其成为生命科学研究领域的热点。通过对细胞通路的探索，可以更清晰地认识细胞增殖过程及疾病发生过程，进而将治疗手段从药物干预提升至基因治疗。已有一些miRNA在临床用于治疗相关疾病，如在骨关节炎、骨质疏松的治疗方面已有了较完善的基因治疗理论依据。未来，应对miRNA这一复杂调控网络进行整体研究，进一步探讨其成骨分化机制，从而促进成骨分化的临床应用和相关疾病的治疗。