表观遗传机制在酒精精神依赖过程中的研究进展

陈增荣,谢晓岩,薛琳媛,李凤青,殷丽天

(细胞生理学教育部重点实验室，山西医科大学基础医学院，太原 030001)

酒精是使用最广泛的成瘾药物之一，长期持续使用和滥用可导致耐受性和依赖性。酒精成瘾是一种严重的精神类疾病，给个人生活以及社会造成巨大的经济负担[1]。表观遗传学是指在基因组中除了DNA和RNA序列以外，还有许多调控基因的信息，虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰，蛋白质与蛋白质、DNA和其他分子的相互作用而影响和调节遗传基因的功能和特性，并可通过细胞分类和增殖周期影响遗传。表观遗传包括组蛋白修饰、磷酸化、甲基化、泛素化等翻译后修饰，组蛋白乙酰化与转录活性状态相关，而某些碱性氨基酸残基的组蛋白甲基化会促进转录抑制[2]，DNA内胞嘧啶碱基的直接甲基化受基因活性的影响，此外微RNA(microRNA，miRNA)也参与调节转录后基因的表达和功能。特定表观遗传机制在疾病的发生和发展期间起着关键作用[3]。体内一些表观遗传修饰的稳定性较高，但很多形式的染色质修饰是可逆的，但如何控制特定染色质在修饰过程中的瞬时与稳定性仍然未知[4]。

有研究认为，导致基因表达可遗传变化的机制是其他过程引起的，而不是基础DNA序列变化(即表观遗传机制)引起的[5]，表观遗传可使人们更好地理解人类疾病的分子机制，包括精神病和酒精使用障碍。现就近几年来表观遗传机制在酒精精神依赖发展中所起的作用进行综述。

1 组蛋白修饰

目前在转录调节中有重要功能的组蛋白共价修饰包括乙酰化(赖氨酸残基)、甲基化(精氨酸和赖氨酸残基)、磷酸化(丝氨酸和苏氨酸残基)、泛素化、ADP-核糖基化(赖氨酸残基)以及脯氨酸异构化。在酒精依赖和酒精滥用的相关研究中发现，组蛋白H3和H4的乙酰化和磷酸化与激活转录有关，而泛素化与转录抑制有关[6]。

1.1组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化反应多发生在核心组蛋白H3和H4 N端的特定Lys残基上，H3乙酰化位点包括Lys9、Lysl4、Lys18和Lys23；H4乙酰化位点包括Lys5、Lys8、Lys12和Lys16[7]，这一过程是由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)调节。组蛋白乙酰化可以降低组蛋白的正电荷，减弱组蛋白与带负电荷的DNA的相互作用。研究发现，基因表达的下降与基因启动子区域乙酰化程度的降低有关，这是由于HDAC通过去除乙酰基抑制HAT的活性，从而导致染色质构象的凝聚和细胞中基因表达水平的降低[8]。组蛋白的乙酰化与成瘾性记忆的形成密切相关。在成瘾过程中，HAT和HDAC调节组蛋白乙酰化的机制与cAMP应答元件结合蛋白(cyclic-AMP responsive-element binding，CREB)信号通路有关。CREB磷酸化后被激活，通过与DNA上的特定序列结合，调节某些基因的转录。磷酸化的CREB募集另一种称为CREB结合蛋白的转录辅因子(CREB-binding protein，CBP)促进基因转录[9]。

在大鼠模型中，杏仁核环路中CREB的信号转导在调节酒精相关行为和酒精抗焦虑中起重要作用[10]。急性给予乙醇后，杏仁核的中央和内侧核发生CREB磷酸化，导致CBP的水平、组蛋白H3和H4乙酰化以及神经肽Y表达增加；另一方面，慢性酒精暴露戒断后会产生相反的效果，导致CREB磷酸化、CBP和神经肽Y水平降低，这与焦虑的发展行为相对应[11]。脑源性神经营养因子是突触可塑性的关键调节因子以及CREB的下游靶基因，也与酒精依赖和焦虑的共病有关[12]。也有研究显示，酒精暴露会降低发育的小脑中CBP的表达和组蛋白乙酰化，这可能是导致与胎儿酒精谱相关的运动缺陷的原因[13]。以上发现提示，CREB信号通路在焦虑和酒精使用障碍中有重要作用。上述研究揭示了组蛋白乙酰化和去乙酰化通过动态调节基因转录，导致神经元可塑性的改变和酒精成瘾行为。

酒精具有抗焦虑作用，但这种抗焦虑作用可被机体快速耐受，这种快速耐受性可能对促进饮酒至关重要，从而有助于酒精依赖的发病。研究发现，HDAC在酒精耐受性和依赖性中具有非常重要的作用。急性给予酒精后，大鼠杏仁核中HDAC的活性受到抑制，用强效HDAC抑制剂曲古抑菌素A治疗可逆转酒精抗焦虑作用快速耐受性行为的出现；反过来，酒精戒断大鼠杏仁核中HDAC的活性增加，这与降低组蛋白乙酰化以及杏仁核和内侧核中神经肽Y基因的表达相关[14]。在酒精戒断期间，用曲古抑菌素A治疗可防止焦虑样行为的发生，纠正组蛋白乙酰化和神经肽Y表达的缺陷[9]。研究表明，CBP水平的变化可能参与急性和慢性酒精暴露引起的杏仁核动态染色质重塑[9]。急性酒精暴露可增加CREB磷酸化水平以及酒精偏好小鼠杏仁核结构中脑源性神经营养因子和细胞骨架相关蛋白的表达[15]。但是，通过CREB和CBP相互作用调节基因表达的表观遗传机制及酒精依赖的整体机制尚未明确，需要进一步研究。

1.2组蛋白甲基化 组蛋白甲基化是通过S-腺苷甲硫氨酸将甲基添加到赖氨酸和精氨酸残基的ε-氨基上。组蛋白的甲基化大多发生在赖氨酸和精氨酸位点，目前发现的赖氨酸甲基化位点包括H3的Lys4、Lys9、Lys27、Lys36、Lys79和H4的Lys20。有证据表明，DNA和组蛋白上的某些赖氨酸和精氨酸残基的甲基化可能涉及一个环路，存在相互加强的关系，是基因表达保持稳定或表观沉默所必需的[16]。组蛋白的甲基化过程是由组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶控制的。不同赖氨酸残基甲基化作用是不同甚至相反的，有的与基因活化相关，有的与基因抑制相关。H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)和H3赖氨酸36的三甲基化(H3K36me3)分别与转录起始和延伸高度相关，通常与转录活性水平的升高相关[17]，并通过H3K9和H3K14的乙酰化加强。已有研究表明，急性酒精暴露大鼠HDAC活性降低，导致H3K4me3增加，转录活性增加，同时H3K9me2减少，基因转录被抑制[18]。在可卡因成瘾者和酒精依赖者的海马中均发现了H3K4me3的改变，因此推测酒精和可卡因介导的表观修饰机制是一样的[19]。而H3赖氨酸9的二甲基化和三甲基化(H3K9me2/3)以及H3赖氨酸27的二甲基化和三甲基化(H3K27me2/3)通常与转录抑制相关，H3K9me3的转录沉默部分是通过募集共抑制蛋白(如异染色质蛋白1)调节的[17]。酒精依赖者伏隔核中H3K9me2的全面减少可能是由酒精诱导的两种甲基转移酶G9a和G9a样蛋白下调所介导[20]，导致H3K9me2的去甲基化和H3K4me2增加，两者最终都有助于开放的染色质状态。因此，组蛋白甲基化是与酒精依赖密切相关的调节机制。

1.3组蛋白磷酸化 组蛋白的磷酸化是由蛋白激酶介导的，与转录激活、DNA修复和细胞周期动力学相关。组蛋白H3的磷酸化可以调节一些重要神经元途径，如丝氨酸10处组蛋白H3的磷酸化与海马中的情境恐惧条件模型有关[21]；蛋白激酶核糖体S6激酶2可以磷酸化H3和CREB，并且在CBP存在的情况下介导调节染色质重塑事件；在H3的丝氨酸10上阻断磷酸化事件能够减少对可卡因和吗啡的行为反应，并阻止对可卡因的条件性位置偏好[6]。精神兴奋类药物，安非他明、可卡因以及吗啡可增加组蛋白H3丝氨酸10的磷酸化，这进一步导致多巴胺和cAMP调节的磷蛋白32在细胞核中被隔离，从而抑制蛋白质-磷酸酶-1，最终促进磷酸化[22]。

总之，在不同酶途径控制下的组蛋白侧链残基的共价修饰如乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化和磷酸化/去磷酸化是在急性或慢性暴露于酒精时改变相关脑组织转录组调控的重要调节机制。这些有助于了解酒精中毒的发生机制以及由酒精状态引起并与之相关的长期神经适应。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是一种重要的基因表达表观遗传调控机制，可导致特定DNA序列中的基因沉默。DNA甲基化模式是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)建立和维持的，然后这些模式被特定蛋白质识别。DNA甲基化主要由三种DNMT调节：DNMT 1保持DNA甲基化模式，而DNMT 3a和DNMT 3b参与DNA的从头甲基化[9]。研究显示，特定胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG岛)的甲基化通过募集许多共抑制因子复合物，干扰转录因子与靶序列的结合，在含甲基结合结构域的蛋白如MeCP2和甲基化CpG结合蛋白1的作用下，将这种抑制性复合物募集到甲基化DNA中，其作用是进一步稳定基因启动子上其他的共抑制子，如HDAC[6]。转录因子CREB的结合受基因启动子处DNA甲基化影响，因为共有cAMP反应元件序列含有CpG岛，当甲基化时，其阻止CREB与靶序列结合[23]。

对酒精依赖性者及其非酒精依赖兄弟姐妹的807个基因的1 505个CpG位点进行甲基化分析发现，前者整体甲基化水平较低[24]。另一个研究小组使用全基因组启动子甲基化微阵列评估酒精依赖人群脑皮质的甲基化谱发现，与非酒精依赖者相比，近57%的酒精依赖者表现出低甲基化[25]。

也有研究得出相反的结论。慢性酗酒者与健康人群相比，外周血单核细胞中基因组DNA的甲基化水平显著增加[26]。与对照组相比，酒精依赖者的淋巴细胞显示出高甲基化，整体DNA甲基化增加，但DNMT3b表达减少[27]。在男性酒精受试者与非饮酒人群的比较发现，同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白启动子区甲基化状态和内质网蛋白信使RNA的表达发生改变，其中酒精受试者内质网蛋白基因启动子的高甲基化是下调基因表达的调节因子。通过比较过去6个月中饮酒女性与未饮酒女性的DNA甲基化模式发现，酒精消耗量与甲基化程度呈正相关[28]。

酒精对DNA甲基化的影响具有多样性，包括一些基因启动子的高甲基化和其他基因启动子的低甲基化[29]。许多基因甲基化水平的改变与酒精依赖相关。与正常对照者相比，酒依赖者在参与认知控制的背外侧前额皮质区域3′非翻译区的突变体中表现出增强的甲基化以及脑中的前体啡肽发生单核苷酸多态性，并且前体啡肽3′非翻译区单核苷酸多态性的甲基化与强啡肽基因表达之间呈正相关[30]。精氨酸加压素基因的DNA高甲基化与酒精依赖密切相关，与此同时，心房利钠基因启动子区域的DNA发生低甲基化[31]。另一项研究显示，酒精依赖者α-突触核蛋白基因启动子区域发生高甲基化，而α-突触核蛋白与长期饮酒时伴随高信使RNA和蛋白质水平造成的酒精依赖有关[32]。与健康对照相比，酒精依赖者血液中脑源性神经营养因子启动子区域甲基化增加，但在酒精戒断14 d后恢复到正常水平[31]。抽取无遗传性疾病家族史的重度饮酒者的血样用于DNA分离发现，配对状同源框2a的甲基化与酒精依赖的严重程度呈正相关[27]。对酒精脑的全基因组DNA甲基化研究发现，与对照样品相比，酒精脑DNMT1转录水平随着大脑皮质区域中长末端重复反转录转座子的DNA低甲基化而降低[33]。

此外，编码N-甲基-D-天冬氨酸受体的基因其表达也受到DNA甲基化的调节。一项临床研究证明，酒精依赖患者戒断期间编码N-甲基-D-天冬氨酸受体2B(N-methyl-D-aspartate 2b receptor subtype,NR2B)受体亚型基因启动子区域的甲基化程度与饮酒严重程度呈负相关[34]。而在原代培养的神经元中，慢性间歇性酒精暴露导致NR2B亚型基因调控区的去甲基化，与NR2B基因表达增加相关[9]。然而，急性乙醇处理并未改变NR2B基因启动子区域甲基化的水平和NR2B基因的表达[35]。使用慢性间歇酒精暴露模型观察到位点特异性(转录因子AP-1和CREB的结合位点)DNA甲基化减少，其在乙醇戒断后持续存在，而这些变化与慢性间歇乙醇诱导的NR2B表达相关[36]。

3 miRNAs

miRNAs是翻译后调节因子，可与靶信使RNA上的互补序列结合以抑制翻译，从而沉默基因表达。研究表明，miRNAs可调节成瘾行为，被滥用药物改变的miRNAs已被证明可调节多种与成瘾密切相关的蛋白质的表达[37]。如miR-124在伏隔核中的过度表达可以减少可卡因的条件位置偏好，而miR-181a的过度表达具有相反的效果[38]。这表明通过药物诱导miRNA的调节也能作为耐受和不断增加酒精摄入量的调节机制。

急性和慢性酒精暴露都会上调培养的纹状体神经元中的miR-9，其可能是通过调节电压依赖的钙离子活化的钾离子通道促进酒精耐受[39]。miR-9也会靶向作用于多巴胺D2受体，影响酒精的奖赏效应[40]。酒精暴露及戒断后对几个与成瘾相关的miRNA进行新一代测序对于揭示特定miRNA的调控至关重要。

4 小 结

表观遗传学是神经科学新兴的研究领域。目前的研究结果表明，杏仁核中组蛋白修饰引起的染色质重塑可能对急性和慢性酒精暴露有重要影响。DNA甲基化作为基因表达水平的关键调节机制，在酒精依赖中也发挥着重要作用。虽然一些研究结果提示HDAC抑制剂可能是治疗酗酒的潜在药物，然而不同类型的HDAC在酒精依赖过程中的特定作用以及酒精暴露对大脑中各种DNMT的调节尚不清楚。目前仍然存在诸多问题需要解决，如基因组序列中的个体差异如何与表观遗传调控中的个体差异相关联；酒精诱导的表观遗传修饰发生在外周组织如血液中，这些变化是否属于成瘾相关现象；在成瘾模型中的表观遗传调控是否存在性别差异。未来的研究将还需要更全面和详细的酒精滥用及依赖调节表观遗传机制证据，以增加对酒精依赖整体基因组功能的理解。