LOX-1在动脉粥样硬化形成过程中的作用研究进展

秦雅红，张振刚，焦云根,※

(1.扬州大学医学院，江苏 扬州 225000； 2.扬州大学附属医院心内科，江苏 扬州225000)

急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是当今世界各国人口死亡率上升的主要原因，基本病理变化为动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是一种与年龄相关的大、中型动脉缓慢发展的疾病，其形成是一个复杂的、受多种致病因素影响的病理生理过程，包括血管内皮损伤、黏附分子表达、白细胞趋化、单核细胞募集、脂质积累、平滑肌细胞增殖迁移和泡沫细胞形成。据报道，血管中低密度脂蛋白的累积是血管壁动脉粥样硬化斑块形成的主要原因；血液中存在溶解氧和其他氧化物质，这些物质对抗氧化物有较强抵抗力且在血管中停留的时间更长，可促进低密度脂蛋白颗粒化学氧化，由此产生的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-denisty lipoprotein，ox-LDL)能促进更多ox-LDL和其他促炎细胞因子的生成，从而形成一种恶性循环反应[1]。这一病理过程是通过一种叫作凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-denisty lipoprotein receptor-1，LOX-1)的清道夫受体介导实现的，LOX-1由Sawamura等[2]于1997年在牛主动脉内皮细胞首次发现，能够与ox-LDL结合，在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用。所以，进一步了解LOX-1在动脉粥样硬化形成机制中的作用显得尤为重要。LOX-1可能作为一种潜在治疗靶点服务临床，降低ACS的发生率和死亡率。现就LOX-1在动脉粥样硬化形成过程中的作用研究进展予以综述。

1 LOX-1的基因结构及表达

1.1LOX-1的基因结构 LOX-1[3]属于E类清道夫受体，是一种分子量为50 000的Ⅱ型膜表面糖蛋白，隶属C型凝集素超家族，由273个氨基酸残基组成。LOX-1[1]由ox-LDL受体1基因编码，ox-LDL受体1基因为单拷贝基因，位于染色体12p12.3～13.2区域，是一个在5′侧翼区近端具有TATA和CAAT盒的诱导基因，TATA盒位于-29 bp，CAAT盒位于-99 bp。LOX-1[3]与自然杀伤基因复合体相似，与其他自然杀伤细胞受体相同，均由四个区域组成，包含一个短的N端细胞质域、一个跨膜域、一个控制受体寡聚的颈部区域和一个细胞外C型凝集素样结构。人类LOX-1基因[1]全长7 000 bp，由6个外显子和5个内含子组成，外显子1～5的大小从102到246 bp不等，第6个外显子更长(1 722 bp)。5′非翻译区和胞质域由外显子1编码，其余胞质域和跨膜域由外显子2编码，颈部区域由颈部域或外显子3编码，外显子4～6编码凝集素样结构域和3′非翻译区，C型凝集素是一种识别并结合特定糖类靶标的蛋白质，LOX-1与C型凝集素的序列具有同源性。诱变研究表明，LOX-1的凝集素域是识别LOX-1配体的功能域，C端残基和几个横跨凝集素域的保守正电荷残基是ox-LDL结合的必要条件[2]。在N端的细胞质结构域中存在几个磷酸化位点，这些位点的磷酸化可传递生物信号或调节LOX-1的功能。

1.2LOX-1的表达及信号转导 LOX-1最早被鉴定为血管内皮细胞摄取ox-LDL的主要受体[3]，随后发现LOX-1也在心肌细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、动脉粥样硬化斑块、血小板中表达[4]。LOX-1在生理条件下表达较低，参与ox-LDL的结合、内吞和蛋白降解，但LOX-1可在多种疾病状态中上调，例如高血压(血管紧张素Ⅱ、内皮素-1)，糖尿病(葡萄糖)，缺氧和机械应激(剪切应力)[5]，肾小球硬化，促炎细胞因子(肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β)等。LOX-1的表达不但受某些疾病调控，解剖位置对其也至关重要，Chen等[6]发现在动脉分叉处LOX-1的表达增加最为显著，这可能是因为位于分叉处的内皮细胞受到复杂(慢性、阶段性和紊乱性)剪切力和周向应变的联合作用。ox-LDL与LOX-1特异性结合，会涉及多种信号通路，如促分裂原活化的蛋白激酶(p38、胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基端激酶)，激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)，沉默信息调节因子1，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，八聚体结合蛋白-1，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nitotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，Noxs)，血管紧张素Ⅱ1型受体，蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶，每种信号通路的激活可能参与动脉粥样硬化的不同过程[7]。

2 LOX-1在动脉粥样硬化中的病理机制

2.1LOX-1促进血管内皮功能失调 动脉粥样硬化始于血管内皮功能障碍，LOX-1是内皮细胞摄取ox-LDL的主要受体[8]；生理条件下，内皮细胞通过分泌一氧化氮或低剂量过氧化氢等血管舒张剂维持血管张力[9]。Hofmann等[10]研究表明，ox-LDL与内皮细胞LOX-1结合产生超氧化物阴离子，减少一氧化氮生成，同时通过活性氧类的增加激活NF-κB，诱导黏附分子产生，增加单核细胞与内皮细胞的黏附，以及内皮细胞的衰老和凋亡。内皮细胞的凋亡可导致内皮功能障碍、动脉粥样硬化的发生和进展过程中血栓形成以及动脉粥样硬化斑块的不稳定。Li和Mehta[11]发现，定向于LOX-1 mRNA的反义寡核苷酸可以抑制ox-LDL介导的单核细胞趋化蛋白-1上调和黏附分子的表达，这意味着抑制LOX-1是保护内皮功能受损和预防动脉粥样硬化形成的重要靶点。

构成血管壁最内层的内皮细胞暴露于流体剪切应力(fluid shear stress，FSS)中，FSS调节内皮功能和血管病理生理。Lee等[12]研究发现，LOX-1在内皮细胞中的表达受FSS模式和强度的调控，并将FSS分为稳定的单向层状剪切应力(laminar shear stress,LSS)和扰动的振荡剪切应力(oscillatory shear stress,OSS)两种模式，其中LSS被认为通过诱导抗动脉粥样硬化基因发挥动脉粥样硬化保护作用，而OSS则被认为通过增加促炎基因和黏附分子的表达产生致动脉粥样硬化性。内皮细胞通过感知血流量的不同模式，检测FSS并转化为内部信号，在此过程中，FSS激活由血管内皮生长因子受体2、血管内皮细胞钙黏附素和血小板内皮细胞黏附分子-1组成的机械感觉复合体，完整的机械感觉复合体允许细胞对不同的剪应力做出反应，并将机械力转换成生物信号，响应流量的变化[12-14]。

Kruppel样转录因子2(Kruppel-like factor 2，KLF2)作为炎症的调节因子，在人血管内皮细胞中表达，通过抗炎、抗血栓和抗迁移功能等发挥动脉粥样硬化保护作用，KLF2-AP-1是FSS调控内皮细胞中LOX-1表达的关键通路[15]。Lee等[12]通过siRNA 和质粒转染，人工调控KLF2表达发现，KLF2的下调增加了LSS中LOX-1的表达，而过表达则抑制OSS中LOX-1的上调，说明KLF2的活化是FSS中LOX-1表达的关键因素。Lee等[12]研究了静态、LSS、OSS条件下LOX-1(mRNA和蛋白)的表达水平，结果显示LOX-1的表达在低OSS水平下显著增加，与LSS相比，低流量和扰动流可上调内皮细胞中LOX-1的表达，静态条件下细胞LOX-1表达水平高于LSS。因此，LSS通过使LOX-1的表达低于OSS和静息状态，发挥动脉粥样硬化的保护作用。生理作用下的LSS，通过KLF2-AP-1通路抑制LOX-1的表达，而超过生理范围的高剪切应力亦是由KLF2-AP-1 途径介导，但LOX-1的表达却呈增加趋势；病理下的高剪切应力表达了类OSS特征，如磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化内皮型一氧化氮合酶、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化胞外信号调节激酶水平较低，细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1水平较高[12]。事实上，已有报道斑块模型中脂质核心节点的FSS均值比正常血管节点高45%，提示脂质丰富坏死核心区域与高剪切应力相关[16]。

Hong等[17]研究证实，LOX-1通过内质网应激通路在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中发挥重要作用。内质网是介导细胞死亡的重要细胞器，内质网中未折叠或错折叠蛋白在各种损伤积累下触发内质网应激并干扰内质网功能，开放蛋白反应能被内质网跨膜传感器激活，作为一种自卫机制，抵消内质网应激产生的损伤，然而，即使内质网应激被解除，细胞仍可能受到损伤或死亡[18]。Hong等[17]发现ox-LDL以剂量和时间依赖方式诱导内皮细胞凋亡，ox-LDL诱导的细胞凋亡与内质网应激通路相关，涉及凋亡基因胱天蛋白酶-12和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein，CHOP)的激活，CHOP在内质网启动的细胞凋亡途径中参与蛋白质的转录抑制，能抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达，胱天蛋白酶-12存在于内质网的细胞质侧，被内质网应激源特异性激活，在内质网应激通路中亦发挥关键作用[19]，内质网应激的严重程度和持续时间决定了细胞的存活或死亡[17]。Noxs是内皮细胞的信号分子，在氧化应激诱导的血管损伤现象中发挥重要作用，Nox-4作为Noxs中的一员，是内皮细胞内质网中超氧阴离子和过氧化氢的主要来源[17]，介导7-酮胆固醇诱导的内质网应激和凋亡，而ox-LDL上调Nox-4能使内质网氧化还原稳态显著破坏，导致细胞凋亡，LOX-1在这一过程中发挥关键作用。这些发现有助于进一步阐明LOX-1在内皮细胞凋亡过程中的具体机制。

2.2LOX-1加速泡沫细胞形成

2.2.1平滑肌-泡沫细胞 在动脉粥样硬化形成过程中，中层的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)发生分化、增殖并迁移至内膜，形成纤维帽和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，ECM主要由巨噬细胞产生的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解，ox-LDL通过调节巨噬细胞中MMP的表达来促进斑块的不稳定性。此外，由于易损斑块纤维帽区域通常较薄，VSMCs较少，因此ox-LDL诱导的内膜VSMCs凋亡亦可增加斑块不稳定性。闫杰等[20]研究表明在VSMCs中，ox-LDL结合LOX-1可通过促凋亡因子(Bax)/抗死亡因子(Bcl-2)依赖途径诱导VSMCs凋亡。维持正常细胞线粒体外膜完整性的Bcl-2蛋白家族Bcl-2、Bcl-xL和髓样细胞白血病-1是抗凋亡介质，而其他Bcl-2家族成员，如Bax、Bak、Bid等，能够促进细胞凋亡，因此抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表达比例可能决定细胞的凋亡潜能[21]。Bcl-2和Bax共同定位于人体内动脉粥样硬化斑块破裂易发区，ox-LDL能上调VSMCs中Bax的表达，Bax的升高和Bcl-2的降低均依赖于LOX-1介导的ox-LDL摄取或结合[22]，Bax/Bcl-2比值的增加致线粒体膜电位变化，促使细胞色素C释放，胱天蛋白酶活化，从而诱导VSMCs凋亡、血管壁损伤，加速动脉粥样硬化斑块形成[20]。

Ding等[21]利用LOX-1的关键调控因子miRNA hsa-let-7g研究了LOX-1在VSMC自噬和凋亡中的作用。自噬是一种保守的细胞内降解过程[23]。细胞凋亡是氧化应激的一种反应，通过LOX-1在人内皮细胞和VSMCs中的激活而介导[24-25]。Ding等[21]通过测定内皮细胞VSMCs中三种不同标志物beclin-1、LC3和Atg5评估自噬：hsa-let-7g转染VSMCs可降低LOX-1表达和活性氧类生成，提高细胞活力，过表达hsa-let-7g能抑制自噬标志物beclin-1、LC3和Atg5的表达，提高VSMCs的存活率。同样，过表达hsa-let-7g抑制剂对自噬和凋亡的影响相反，所以，hsa-let-7g的作用与LOX-1抗体相似，通过调控胱天蛋白酶-3、Bax、Bcl-2和Bcl-xL影响细胞凋亡。因此,hsa-let-7g有可能成为进一步研究动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。

2.2.2单核-巨噬-泡沫细胞 脂质被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的早期事件。单核细胞被促炎刺激吸引，附着在炎症血管内皮上，迁移至内膜下层并在内膜下积累，随之分化为巨噬细胞并吞噬ox-LDL形成泡沫细胞。巨噬细胞内脂质平衡被破坏导致胆固醇的积累和泡沫细胞的形成[3]，泡沫细胞是脂肪条纹的重要组成部分，是斑块中最易破裂的主要细胞类型，减少泡沫细胞形成或低密度脂蛋白胆固醇吸收可减轻动脉粥样硬化斑块的形成[26]。

AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的活化有助于心血管健康[27]。Chen等[8]发现AMPK在泡沫细胞转化，特别是在巨噬细胞摄取胆固醇中有重要作用。活化的AMPK导致巨噬细胞胆固醇摄取减少，抑制ox-LDL介导的巨噬细胞泡沫细胞形成，这种功能的改变是由LOX-1的mRNA和蛋白表达下调引起的。实验细胞培养模型研究发现，AMPK通过蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A)/NF-κB/LOX-1途径对ox-LDL摄取起作用，PP2A是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，被确定为NF-κB的关键调节因子，PP2A在AMPK激活时对p65磷酸化的调节起关键作用，活化的AMPK刺激NF-κB去磷酸化从而降低LOX-1的表达，相反AMPK则通过促进p65的去磷酸化诱导LOX-1增加，这进一步证实AMPK通过控制NF-κB 转录活动参与LOX-1的表达。ApoE-/-小鼠体内实验表明[28]：当巨噬细胞暴露于H007或AICAR(AMPK激动剂)时可增加PP2A磷酸酶活性，刺激NF-κB去磷酸化从而降低LOX-1的表达，缩小动脉粥样硬化斑块的面积，这些结果表明AMPK参与PP2A介导的NF-κB去磷酸化和LOX-1的下调。AMPK激活的潜在机制不同，但AMPK对LOX-1表达的调节机制是明确的，AMPK通过抑制胆固醇对巨噬细胞的摄取而发挥抗动脉粥样硬化作用。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一种参与脂质代谢和细胞凋亡的脂质调节蛋白，可以影响巨噬细胞生物学功能和调节动脉粥样硬化的发生[29]。炎症在动脉粥样硬化形成过程中至关重要，单核细胞/巨噬细胞是炎症免疫激活级联反应的重要组成部分，Giunzioni等[30]指出脂多糖刺激巨噬细胞中的PCSK9可以增加促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α和IL-1β的mRNA水平，并且在低密度脂蛋白受体依赖性机制中抑制抗炎细胞因子IL-10和Arg1的转录水平。PCSK9是一种炎性分子,可能在促炎环境增进ox-LDL摄取中发挥重要作用。有研究指出肿瘤坏死因子-α可以显著增加巨噬细胞PCSK9表达，暗示炎症状态可以在转录水平上增加巨噬细胞中PCSK9 的表达，同时PCSK9又可激活肿瘤坏死因子-α引发的巨噬细胞清道夫受体LOX-1的表达， PCSK9和肿瘤坏死因子-α相互作用，通过加重炎症反应和ox-LDL的摄取发挥动脉粥样硬化作用[31]。

对PCSK9转基因(PCSK9trans)巨噬细胞进行研究，发现PCSK9trans巨噬细胞中的ox-LDL摄取显著增加[31]。ATP结合盒转运蛋白A1和ATP结合盒转运蛋白G1[ATP-binding cassette (ABC) transporter G1, ABCG1]在单核巨噬-泡沫细胞的胆固醇流出中起关键作用，ATP结合盒转运蛋白A1是反向胆固醇运输的关键蛋白质，促进巨噬细胞胆固醇流出，防止泡沫细胞的形成。ABCG1 是一种活跃的脂质转运体，在巨噬细胞中表达并参与反向胆固醇运输，ABCG1表达可抑制胆固醇过度积累，减少泡沫细胞的形成[32-33]。PCSK9通过抑制反向胆固醇运输、引起炎症反应和胆固醇积累在巨噬细胞中上调，并通过增强巨噬细胞对胆固醇的吸收而加速动脉粥样硬化的发生发展[34]。

2.3LOX-1影响动脉粥样斑块稳定性 动脉粥样硬化斑块由覆盖有纤维帽的脂质核心组成，纤维帽主要由含有大量胶原纤维的ECM、平滑肌细胞和少量巨噬细胞组成；脂质核心由巨噬细胞、平滑肌细胞和ECM组成。动脉粥样硬化斑块分为稳定斑块和不稳定斑块，不稳定斑块表现为纤维帽溃疡、斑块破裂、斑块内出血，是心绞痛、心肌梗死的发生基础。ox-LDL与LOX-1结合介导多种生物学效应，导致动脉粥样硬化斑块失稳，不稳定斑块一般有较大脂核，薄弱纤维肌帽，单核细胞诱导的促炎反应增强等特征。MMPs的表达更容易使斑块发生破裂。MMPs主要由巨噬细胞释放，活化后的MMP对ECM的亲和力更高，可降解各种ECM成分，削弱纤维帽结缔组织，从而增强斑块的不稳定性[35]。

Ishino等[36]通过免疫组织化学分析了LOX-1表达与家兔斑块不稳定性的关系，结果发现LOX-1表达与斑块不稳定性指数和MMP-9表达呈正相关，LOX-1在纤维肌帽较薄(<100 μm)的动脉粥样硬化斑块中表达增加，在巨噬细胞丰富的脂质核心区表达更为明显。这些结果表明LOX-1与动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关，MMP-9可能是LOX-1与斑块不稳定性之间的桥梁。MMP蛋白家族强大，除MMP-9外，其他家族成员亦被相继发现，其中MMP-1通过降解斑块内胶原蛋白促进斑块扩张、破裂和出血；MMP-2通过降解ECM和消除细胞-基质相互作用促进斑块破裂并诱导VSMCs凋亡；MMP-12通过降解ECM组分促进动脉粥样硬化的进展。

Hu等[35]发现在晚期动脉粥样硬化家兔中，MMP-1、MMP-3和MMP-9的上调和MMP-14的下调会导致斑块中的血管生成和斑块不稳定性的增加。陈润泰等[37]研究表明，血管新生在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用，斑块破裂与微血管形成增加密切相关；易损斑块内营养血管数量是稳定斑块内营养血管数量的2～4倍，动脉粥样硬化斑块及其稳定性与血管生成密切相关，为进一步研究动脉粥样硬化斑块稳定性提供方向。

3 小 结

LOX-1是一种在血管细胞(内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)中普遍表达的多功能受体，与动脉粥样硬化的发生、发展以及动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关。LOX-1的致病机制复杂，不仅局限于心脑血管疾病，在肺动脉高压、胃肠疾病、类风湿疾病、糖尿病及肿瘤的发生发展中都起着重要作用，因此研究LOX-1对心脑血管疾病与其他类型疾病机制的相关性也至关重要。随着人们从LOX-1角度研究动脉粥样硬化发病机制的不断深入，冠心病靶向治疗越来越受到重视，在精准医疗模式背景的推动下，LOX-1基因干预、LOX-1靶向抑制剂可能为心血管疾病的预防、治疗及预后提供新的诊疗思路和方向。