替米考星固体分散体的制备与物相鉴定

巴娟，张勇军,邓桦,杨少林,李进,杨鸿*

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231；2.广东养宝生物制药有限公司，广东佛山 528300)

替米考星(Tilmicosin)是一种以泰乐菌素为前体半合成的大环内酯类畜禽专用抗生素[1]。替米考星对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、支原体、螺旋体等均有良好的抑制作用，对胸膜肺炎放线菌、巴氏杆菌具有比泰乐菌素更强的抗菌活性，与临床常用抗生素无交差耐药性[2]。替米考星在水中极难溶解，具有较强的苦味，口服对胃部黏膜有刺激，生物利用度较低，在兽医临床上主要通过拌料给药，由于动物患病时易食欲不振，不能起到及时治疗疾病的作用，导致其在兽医临床上推广应用受到限制。固体分散体技术是将难溶性药物以微晶态、胶态、无定形态或分子状态高度分散在载体材料中的新型制剂技术，固体分散体技术可以提高难溶性药物的体外溶出速率，以改善药物的吸收和生物利用度[3-5]。为增加替米考星的水溶性，提高其生物利用度，方便饮水给药，及时治疗疾病，本试验选用PEG6000和P188作为载体，采用熔融法制备替米考星固体分散体，旨在制备一种稳定、速溶的替米考星固体分散体制剂，给养殖业带来更大的方便以及利益。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 替米考星对照品(含量93.9%，批号：K0311407，中国兽医药品监察所)；替米考星原料药(含量95.86%，批号：T2017127043，宁夏泰瑞制药有限公司)；聚乙二醇6000(PEG6000，批号：EK170713，上海伊卡生物技术有限公司)；泊洛沙姆188(P188，巴斯夫(中国)有限公司)；磷酸、甲醇、乙腈、二正丁胺、四氢呋喃均为色谱纯。

1.2 仪器设备 LC-15C高效液相色谱仪(岛津企业管理(中国)有限公司)；MS-H-Pro+磁力搅拌器(大龙兴创实验仪器有限公司)；RC-3溶出度测定仪(天津市新天光分析仪器技术有限公司)；X射线多晶衍射仪(德国Bruker D8 ADVANCE)；Bruker Vertex傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)。

1.3 替米考星含量测定方法的建立

1.3.1 色谱条件 色谱柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为水∶乙腈∶磷酸二丁胺∶四氢呋喃(805∶115∶25∶55)；检测波长280 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min。

磷酸二丁胺溶液(1 mol/L)：取二正丁胺168 mL，加10%磷酸溶液700 mL，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至1000 mL。

1.3.2 线性关系考察 精密称量25 mg替米考星对照品，置于50 mL量瓶中，加入10 mL乙腈，超声溶解，用10%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成500 μg/mL的储存液。分别取储存液0.1、0.5、1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，用10%磷酸溶液稀释至刻度，得到5、25、50、100、150、200、250、300 μg/mL的稀释液，分别取各浓度稀释液20 μL进样，记录色谱图峰面积，以替米考星溶液的浓度对峰面积作线性回归，得到线性回归方程为y=27767x-55380(r2=0.9999)，替米考星浓度在5～300 μg/mL范围内，与峰面积线性关系良好。

1.4 替米考星固体分散体的制备

1.4.1 载体筛选 分别取处方(表1)中的载体置于烧杯中，57 ℃水浴加热至完全熔融，按处方加入替米考星，边加边搅拌，使替米考星完全融于介质中。搅拌2 h后从水浴中取出烧杯，迅速倒入预冷的不锈钢托盘中，然后转移至-20 ℃的冰箱固化4 h，取出置35 ℃鼓风干燥箱干燥24 h，从托盘中取出，研碎，过80目筛，置干燥器避光保存[6-8]。

表1 替米考星固体分散体配方Tab 1 Formulation of the tilmicosin solid dispersion

1.4.2 正交试验设计 通过载体筛选等单因素考察后，按照正交设计表L9(34)，以三因素药载比(A)、搅拌时间(B)、固化时间(C)三水平进行设计(表2)，以累积溶出度为指标筛选出替米考星固体分散体的最佳制备工艺。

表2 正交试验设计因素和水平Tab 2 Factors and levels of orthogonal design

1.5 溶出度测定 按兽药典中的桨法测定药物溶出度[9]。取替米考星固体分散体适量(相当于替米考星原药100 mg)，溶出介质为经脱气处理的蒸馏水900 mL，温度37 ℃，转速100 r/min，分别于2、5、10、15、20、30、45、60 min时定量取样5 mL，同时补充等量同温介质5 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法分别测定峰面积，代入标准回归方程，计算药物的累积溶出度。同一样品连续测定3次。

1.6 固体分散体物相鉴定 参照固体分散体表征手段[10]，本试验选用X-射线衍射、傅里叶变换红外光谱用于替米考星固体分散体的物相鉴定。

1.6.1 X射线衍射法 将替米考星原料药、载体、物理混合物、固体分散体研碎过80目筛，进行X射线衍射分析，检测依据为JY/T 009-1996转靶多晶体X射线衍射方法通则。测试条件：Cu靶，PIXcel ID探测器，Ni滤波片，电压：40 kV，电流：40 mA，角度范围：3°～60°，扫描速度：12°/min，取适量样品填充样品槽，压实刮平，使用正装法进样，分别进行X射线衍射分析。

1.6.2 红外光谱法 将替米考星原料药，载体，物理混合物、固体分散体研碎过80目筛，进行傅里叶红外光谱的分析，检测依据为GB/T 6040-2002红外光谱分析方法通则，分别取适量样品与KBr混合后压片，在400～4000 cm-1进行红外扫描，分辨率4 cm-1，扫描次数32次，进行红外光谱分析，记录图谱。

2 结果与分析

2.1 载体筛选结果分析 由累积溶出度图(图1)可知，选用PEG6000单一载体制备替米考星固体分散体，溶出速率并不是太快，2 min时溶出度只达到20%，随着载体P188比例的增加，固体分散体的溶出速率越快，累积溶出度越高。但实际制备过程中，随着载体P188比例的增加，固体分散体的粘性越大，易粘结成团。最终试验选用联合载体PEG6000∶P188=20∶1制备替米考星固体分散体，提高溶出速率的同时，也能够避免单一载体制备替米考星固体分散体出现的缺陷。

图1 累积溶出度图Fig 1 Chart of cumulative dissolution

2.2 正交试验与溶出度结果 根据正交试验结果(表3)可知，A3>A2>A1，B1>B3>B2，C3>C1>C2，最优制备工艺为A3B1C3，即药载比1∶3，搅拌时间1 h，固化时间12 h。此制备工艺制备的替米考星固体分散体在2 min时溶出度达到71.8%，15 min时可完全溶解，显著提高了替米考星的溶出速率。

表3 正交试验结果Tab 3 Results of orthogonal experiment

2.3 X射线衍射分析 由图2可知，替米考星在低角度出现一些衍射峰叠加在一起，没有特征衍射峰出现，说明替米考星是非晶态，是一种无定型物质。联合载体、物理混合物、固体分散体在衍射角19°和23°处分别具有较强的衍射特征峰，但物理混合物、固体分散体的衍射峰都有降低，说明载体为晶体结构，替米考星主要以无定型状态分散在载体中，替米考星固体分散体为晶体结构，这与其他文献中报道的检测结果一致[11]。

图2 X射线衍射图谱Fig 2 Results of X- ray diffraction

2.4 傅里叶红外光谱分析 参照文献中替米考星、PEG6000和P188红外光谱图分析[11-13]，由红外光谱图(图3)可知，替米考星在3452cm-1处具有一个较宽吸收峰，是游离的羟基伸缩振动吸收峰，在2933～2836 cm-1处具有吸收峰，是-CH3、-CH2的伸缩振动峰，在1741、1679 cm-1处具有稍弱吸收峰，是碳碳双键与羰基的不饱和伸缩振动吸收峰，在1593cm-1、1457cm-1有尖锐吸收峰，是N-H和C-H的振动吸收峰，在1168、1083 cm-1处有较强吸收峰，是C-O和C-O-C的伸缩振动吸收峰。

A为替米考星，B为联合载体，C为替米考星和联合载体物理混合物，D为替米考星固体分散体图3 红外光谱图Fig 3 Fourier infrared spectroscopy

通过对比替米考星、载体与固体分散体红外光谱图，固体分散体中的替米考星在3452 cm-1处的吸收峰发生了移动，而且吸收峰的强度明显降低，在1741、1679、1593 cm-1处的吸收峰明显降低，在1457 cm-1和1168 cm-1的吸收峰已经消失。载体的特征吸收峰基本都在，并且无较大变化，说明替米考星已分散于载体中，为替米考星固体分散体的形成提供参考依据。

3 讨论与结论

近几年来，有人在替米考星制剂的研究中采用了微囊、纳米乳、包合物、脂质体等新技术，在一定程度上，提高了药物的溶解度，掩盖了替米考星的苦味，并且具有缓释、靶向的作用[14-16]。但是大部分技术需要加入大量有机试剂，难以除尽，存在成本较高、步骤繁琐、污染环境等问题，因而限制了增溶新技术在替米考星制剂实际生产中的应用。

熔融法制备固体分散体时，不需要加入有机试剂，且制备工艺简单。目前固体分散体的老化现象限制了该技术在工业生产和临床上的应用，可以通过调整载体理化性质、采用联合载体、改善贮存环境等因素提高固体分散体的稳定性。PEG6000是一种水溶性高分子聚合物，具有良好的水溶性和生物相容性，而P188是一种非离子型表面活性剂，载药量大，能抑制产品结晶[17-18]。

本试验分别选用了PEG6000和P188作为载体制备替米考星固体分散体，结果发现PEG6000作为载体制备的固体分散体质地硬，溶出速率稍慢，2 min时溶出度达到20%，而P188作为载体制备的固体分散体质地较软，粘性大，流动性差，但溶出速率较快，2 min时溶出度达到70%。P188价格也较为昂贵，综合各因素考察，试验选用PEG6000和P188联合载体，经过筛选，选用PEG6000∶P188=20∶1制备替米考星固体分散体，通过正交试验对制备工艺进行优化，X射线衍射法和傅里叶红外光谱法也说明替米考星固体分散体形成，替米考星以无定型态分散于载体中。该制备工艺简单，避免了单一载体制备替米考星固体分散体出现的缺陷，提高溶出速率的同时，又能降低经济成本，替米考星固体分散体易溶于水，方便饮水给药，可及时治疗疾病，给养殖业带来更大的方便以及利益。