基于SRY基因鉴定新疆野兔性别

2019-02-26张玉琮代慧英单文娟

野生动物学报 2019年1期

张玉琮代慧英单文娟

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐，830046)

兔属动物适应性强，生存环境多种多样，而新疆是我国陆地面积第一大省，有着丰富多样的生态环境，广泛分布着4种野兔。包括以适应干旱著称的塔里木盆地特有物种——塔里木兔(Lepusyarkandensis)，以适应严寒著称、分布在新疆北部寒冷地区的雪兔(Lepustimidus)，分布在帕米尔高原及新疆中东部地区的藏兔(Lepustibetanus)，以及分布在塔里木盆地以北、乌鲁木齐以西广大地区的托氏兔(Lepustolai)[1]。新疆兔属物种，是该地区十分重要的资源动物，尤其塔里木兔和雪兔被列为国家Ⅱ级保护动物[2]。野兔性别的鉴定是对野兔种群开展生态学、群体遗传学等方面研究的前提和基础之一。然而兔属动物的性二型性不明显，尤其是幼体，而且从野外收集到的组织样本大多是不完整的，所以直接利用外部形态特征的方法鉴定性别并不合适。

研究表明，SRY 基因(Sex determining region Y gene，Y染色体性别决定基因)是哺乳动物Y染色体上起着性别决定的序列，是控制性别的睾丸决定因子(TDF)的遗传基础，也是胚胎发育过程中雄性个体区别于雌性个体的关键基因[3-4]。因此，作为性别鉴定的重要遗传标记之一，其在遗传病防控，家畜性别控制，动物性别鉴定等方面有着广泛的应用[5-7]。

近些年来，随着性别决定理论的研究，性别鉴定的方法也由个体水平、细胞水平发展到了分子水平。虽然目前已有许多种鉴定性别的方法，如核型分析法、间接免疫荧光法、Y染色体特异性DNA探针法、PCR扩增法等[8-10]。但在哺乳动物的性别鉴定中得到了广泛应用且效果较好的仍然是利用双重PCR法扩增SRY基因保守区的方法[11-12]。该方法是同时扩增SRY基因和APP基因(Amyloid precursor protein gene，淀粉样前体蛋白基因)，后者是一段物种进化过程中高度保守的序列，其表达产物是一种广泛存在于哺乳动物体内的多功能跨膜蛋白[13]。

本文运用SRY基因作为雄性个体遗传标记，APP基因作为阳性对照分别设计引物。将蛋白酶K法提取的121例野兔样本的总DNA利用双重PCR体系扩增出与之相对应的特异性序列，并且对扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳条带分析结果。利用这一方法将采自全疆9个地区的4种野兔标本进行了性别鉴定。本研究不仅有助于结合野兔形态学特征，进一步探讨新疆野兔的分类、群体遗传学和分子进化，而且对新疆野生兔类资源的保护开发和管理利用也有着一定的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

10例已知性别的哺乳动物样本，包括：雌雄各1例的野兔和家兔，雌雄各1例的猪、牛、羊家畜样本。分别采自阿克陶、乌恰、塔县、阿克苏、阿拉尔、阿勒泰、达坂城、托克逊、库尔勒9个地区121例未知性别的野兔样本(包括皮张和肌肉组织)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶K法提取基因组DNA并电泳检测

取0.2 g组织样剪碎放入2 mL EP管中，加500 μL HOM Buffer及10 μL 20 mg/mL蛋白酶K混合均匀，56℃水浴消化至溶液透明。再加入500 μL 2.25 M的NaCl溶液及300 μL氯仿，充分混匀15 min，10 000 rpm 离心10 min后进行抽提。将600 μL上清液转移到另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀后，置于-20 ℃下2 h 以上以沉淀DNA。13 000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀中加入500 μL 70%乙醇，洗涤5 min后，13 000 rpm 离心10 min，弃上清液，干燥DNA沉淀。加50 μL灭菌双蒸水，溶解DNA。

取2 μL提取产物，与等体积的上样缓冲液混合，经1.0%琼脂糖凝胶(含0.15% Gold View I型核酸染色剂)电泳，通过凝胶成像系统照胶分析后，记录结果。

1.2.2 双重PCR扩增

依据赵建军文献[14]设计两对引物，详见表1。其中一对引物SRY282扩增Y染色体性别决定区域282 bp的片段，另一对引物APP173作为PCR反应的阳性对照扩增常染色体173 bp的片段。引物由上海生工委托合成。PCR反应的总体系为25 μL：浓度为10 μM的SRY282与APP173上下游4条引物各1 μL，13 μL PremixTaqTM溶液(PCR反应预混液)，1～3 μL的模板(根据DNA提取产物凝胶电泳的亮度判断)，加无菌去离子水补足至25 μL。循环参数：首先95℃预变性4 min，然后95℃变性20 s、53℃复性30 s、72℃延伸30 s循环30次，最后72℃延伸3 min。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

1.2.3 电泳检测

取6 μL PCR扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶(含0.15% Gold View I型核酸染色剂)电泳，通过凝胶成像系统照胶观察，对比maker后，记录结果。

2 结果

2.1 新疆野兔标本总DNA提取产物电泳结果

用蛋白酶K法提取总DNA，部分结果如图1，基因组DNA条带清晰，部分样品有轻微降解且存在RNA和蛋白质杂质。总的来说，可以满足下一步实验要求。

图1 新疆野兔部分标本总DNA提取产物电泳结果Fig.1 Total DNA extraction results of Xinjiang hares

2.2 已知性别样本的SRY与APP基因PCR产物电泳结果

对已知性别的野兔、家兔、羊、牛、猪进行性别鉴定，其中野兔、家兔成功鉴定出性别。从图2可以看出，雄性个体扩增出282 bp和173 bp两条特异性条带，雌性个体仅扩增出173 bp的一条特异性条带。且鉴定结果与实际完全一致。

图2 已知性别样本的SRY与APP基因PCR产物电泳结果Fig.2 PCR results of SRY gene and APP gene in gender-known samples 注：泳道M为maker DL1 000；泳道1、2是雌性与雄性野兔的电泳结果；泳道3、4是雌性与雄性家兔的电泳结果；泳道5～10分别是牛、羊、猪3种家畜一雌一雄的电泳结果 Note：Lane M for maker DL1 000.Lane 1 and 2 were PCR results of female and male hare.Lane 3 and 4 were PCR results of female and male rabbit.Lane 5-10 were PCR results of one female and one male of cattle，sheep and pig，respectively

2.3 新疆野兔未知性别样本的SRY与APP基因PCR产物电泳结果

相同反应条件下对121例未知性别的新疆野兔标本进行性别鉴定。其中有69例扩增出了173 bp的一条带，判定为雌性个体，52例扩增出了282 bp和173 bp的两条带，判定为雄性个体。各采集地野兔样本雌雄个体数目的详细结果见表2。部分电泳结果见图3。

表2 新疆9个采集地121例野兔样本雌雄个体数目

Tab.2 The number of males and females in 121 Xinjiang hare samples from 9 regions

图3 未知性别的新疆野兔样本的SRY与APP基因部分PCR产物电泳结果Fig.3 PCR results of SRY gene and APP gene in gender-unknown hare samples in Xinjiang 注：泳道M为maker DL1 000；泳道1、3、4、6、9、10为雄性野兔；泳道2、5、7、8为雌性野兔 Note：Lane M for maker DL1 000.Lanes 1，3，4，6，9，10 for male hares.Lanes 2，5，7，8 for female hares

3 讨论

兔类基因组DNA大小约2.81Gb(源自哺乳动物基因组计划数据，http：//www.broad.mit.edu/ftp/pub/assemblies/mammals/rabbit/oryCun1/BasicAssemblyOneLiner.out)。本研究首先尝试了利用CTAB法来提取野兔基因组DNA，但是提取效果不理想。之后又采用了经典的蛋白酶K法来提取野兔肌肉或皮张的基因组DNA。由于所用的野兔样本为2003年至今本实验室所保存和采集的，部分样本采集时间较为久远，有的样本是在路边捡到的已风干的皮张组织，因此提取的总DNA存在轻微降解情况。

本实验中影响PCR扩增结果的因素可能有两点，首先，由于同一个体系内加了2对引物，之间势必会有引物竞争和形成引物二聚体，影响PCR的扩增效果[15]。此外，由于提取过程中只进行了一次抽提，提取产物仍有较多杂质，这也是影响PCR结果的原因之一。

为了防止扩增失败而对结果造成误判，选用双重PCR的方法同时对SRY基因及一个与性别无关的持家基因(APP基因)进行扩增。对扩增产物电泳后，同时出现两条带的为雄性，一条带的为雌性。若无任何扩增产物，则不能判断性别。这一方法提高了PCR结果的可靠性，避免了结果的假阳性。本实验先选用已知性别的4例兔属动物和6例非兔属动物家畜进行检验，兔属动物的实际性别与实验结果一致。雄性样本扩增出两条特异性条带，分别是173 bp的APP与282 bp的SRY条带；雌性样本仅扩增出了173 bp的APP条带。而非兔属动物并未扩增出任何条带，证明了此特异性引物的可靠性和该方法的有效性。而后我们采用此方法鉴定了121例未知性别的新疆野兔样本，其中69例为雌性，52例为雄性。经卡方检验后，χ2=2.388，P>0.05，符合1∶1的性别比例，与野兔自然种群的性别比例一致[16-18]，结果可靠。但由于各个地区的野兔标本采集数量不是足够多，不能直接探讨各小种群的性别比例，今后可以联合野兔外形特征等数据进一步分析种群结构，探讨新疆野兔的分类和系统发育关系，为野生兔类保护和利用奠定基础。