脂肪酸代谢酶系在孤独症前额叶大脑皮质的表达☆

陈建玲 傅迎美 禹顺英 王艳玲

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）临床表现为两大主要症状：社会交流和互动方面持续的缺陷和局限，重复的行为、兴趣或活动模式[1]。最新数据显示，美国孤独症谱系障碍的患病率正在增加[2]。根据孤独症和发育残疾监测网络（Autism&Developmental Disabilities Monitoring，ADDM）的数据，2014年儿童中孤独症谱系障碍的患病率为16.8/1000，是2000年ADDM监测结果的2倍多[2-3]。目前ASD的诊断主要依据症状，缺乏可靠的生物学诊断指标，也无特效的治疗手段[4]。本课题组前期研究发现，糖类及脂质代谢异常可能参与孤独症的发病[5]。近年有研究显示ASD患者血浆中脂肪酸合成酶 （fatty acid synthase，FAS）表达增加[6]。本课题组前期研究还发现，孤独症模型大鼠前额叶大脑皮质和小脑组织中FAS和乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）表达增加[7]。孤独症患者脑组织中是否也存在FAS、ACC等脂肪酸代谢酶的表达异常，目前尚缺乏研究。为此，本研究拟探讨脂肪酸代谢酶系在ASD脑组织中的表达特点及意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象ASD组儿童的脑组织购自发育障碍患者脑和组织库（Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders，BTBDD）。ASD 组入组标准：①符合 《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）孤独症诊断标准并由专科医生确诊；②年龄3～15岁；③性别不限；④死后间隔时间0～24 h；⑤生前无抗精神病药用药史；⑥除外脑部疾病和外伤的突然死亡；⑦脑组织为新鲜冰冻组织。排除标准：①存在脆性X综合征或其他广泛发育障碍者；②患有强迫症、情感障碍或其他精神障碍者；③合并神经系统变性疾病、脑外伤或脑血管病者。ASD组共入组8例。所有组织均由组织库获得家属知情同意用于研究。

对照组儿童的脑组织购自美国国家儿童保健和人类发育研究所（National Institute of Child Health and Human Development，NICHD）。 对照组入组标准：①生前无精神疾病；②年龄3～15岁；③性别不限；④死后间隔时间0～24 h；⑤生前无抗精神病药用药史；⑥除外脑部疾病和外伤的突然死亡；⑦脑组织为新鲜冰冻组织。对照组排除标准：同患者组。对照组共入组8例。所有组织均由组织库获得家属知情同意用于研究。

1.2 研究方法

1.2.1 脑组织匀浆制备 所有样本取前额叶大脑皮质。首先制备组织匀浆缓冲液，成分为50 mmol/L Tris-HCl（pH 为 7.4），8.5%蔗糖，2 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），10 mmol/L β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol），以及蛋白酶抑制剂 cocktail（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）； 匀浆缓冲液冰上预冷；然后将购买的新鲜冰冻前额叶皮质脑组织分别按体积与质量百分比（10%V/W）加入预冷的组织匀浆液，4℃充分匀浆1 min，直至溶液无肉眼可见的沉淀；最后将匀浆液分装至EP管中，备用。

1.2.2 脂肪酸代谢酶表达检测 采用蛋白质印迹法（western blotting）检测前额叶皮质中脂肪酸代谢酶表达水平。先用BCA法检测蛋白浓度 （采用Thermo Scientific公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒），再根据蛋白质样品浓度，用Laemmli蛋白上样缓冲液及脑组织匀浆缓冲液制备脑组织蛋白样品，经凝胶电泳转移蛋白质至PVDF膜。然后室温封闭 1 h，4℃过夜孵育一抗 （Cell Signaling Technology，USA）（1:1000）：FAS（C20G5）兔单克隆抗体（#3180）、ACC （C83B10）兔单克隆抗体（#3676）、AceCS1 （D19C6） 兔单克隆抗体（#3658）、ACSL1（D2H5）兔单克隆抗体（#9189）、β-actin 兔单克隆抗体（#8457S）。室温下孵育二抗——HRP标记羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology，USA）（1:2000）（#7074）1 h，暗室中显影鉴定。 以 β-actin兔单克隆抗体 （Cell Signaling Technology，USA）（#8457S）作为参照。所得图像经扫描仪记入电脑，用Image J软件（NIH，美国）分析目标条带的灰度值，以灰度值比值 （目标条带的灰度值/β-actin的灰度值）反映各种蛋白表达水平。

1.3 统计学方法用IBM SPSS Statistics 20.0进行统计分析。两组间年龄、死后间隔时间及脂肪酸代谢酶表达水平比较采用独立样本t检验，性别比较采用χ2检验。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 基本资料ASD组年龄 4～14岁，平均（9.12±3.39）岁，男 5例、女 3例，死后间隔时间 9～24 h，平均（15.12±4.79）h。对照组年龄 4～14 岁，平均（8.37±3.73）岁，男 5 例、女 3 例，死后间隔时间10～21 h，平均（16.75±3.41）h。两组年龄、性别构成、死后间隔时间等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。组织标本供者的基本资料见表1。

2.2 前额叶大脑皮质ACC表达水平孤独症组ACC灰度值比值为 1.09±0.24，对照组为 0.92±0.11。孤独症组比对照组略高，但差异无统计学意义（t=-1.81，P=0.10）。 见图 1。

2.3 前额叶大脑皮质FAS表达水平孤独症组FAS的灰度值比值为0.61±0.70，对照组为0.49±0.10。两组之间差异有统计学意义 （t=-2.82，P=0.01），孤独症组高于对照组。见图1。

2.4 前额叶大脑皮质AceCS1表达水平孤独症组AceCS1的灰度值比值为 0.77±0.07，对照组为0.72±0.05。两组之间差异无统计学意义（t=-1.79，P=0.09）。 见图 1。

2.5 前额叶大脑皮质ACSL1表达水平孤独症组ACSL1的灰度值比值为 0.85±0.13，对照组为0.69±0.11。孤独症组高于对照组，差异有统计学意义（t=-2.75，P=0.02），孤独症组 ACSL1 蛋白表达水平是对照组的1.24倍。见图1。

3 讨论

本研究发现孤独症患儿前额叶大脑皮质中ACSL1和FAS的表达明显增加。FAS在脂肪酸合成中起关键作用，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成长链脂肪酸[8]。ACSL1在脂肪酸碳链的延长过程中发挥重要作用[9]。ACSL1和FAS的表达增加提示孤独症前额叶大脑皮质中可能存在脂肪酸合成增加。

图1 脂肪酸代谢酶系在孤独症和对照组前额叶大脑皮质中的表达情况。孤独症组FAS和ACSL1的蛋白表达均高于对照组 （均P＜0.05），ACC和AceCS1的表达两组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）

表1研究对象基本信息

本研究结果与既往文献类似，ZAKAREIA等[6]发现孤独症患者血浆中也存在FAS表达增加，且FAS的表达水平与孤独症的严重程度呈正相关关系。此外，本课题组前期的动物模型研究也发现孤独症前额叶大脑皮质及小脑组织中FAS、ACC表达增加[7]。与动物模型研究结果不同的是，本研究未发现孤独症前额叶大脑皮质中存在ACC表达增加，而存在ACSL1的表达增加，提示人类孤独症前额叶大脑皮质可能在脂肪酸合成过程中碳链延长较为活跃。MEWS等[10]研究发现AceCS在维持哺乳动物海马区神经元功能及改善记忆方面有显著作用。本研究未发现AceCS1在孤独症组前额叶大脑皮质与对照组有差异，提示AceCS可能在哺乳动物不同脑区中功能不同，或者AceCS可能存在多种亚型。

脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，目前已有研究表明omega-3多不饱和脂肪酸不足可能可引起前脑无裂畸形及胼胝体发育障碍[11-12]。而胼胝体发育障碍的小鼠在行为学上又表现出类似于人类孤独症的核心症状[13]。此外，给伴有ASD症状的早产儿补充omega-3和omega-6多不饱和脂肪酸可以部分改善患儿的社交技能缺陷[14]。这些研究表明，脂肪酸异常可能参与孤独症的发病。本研究也发现孤独症患儿可能存在前额叶大脑皮层中脂肪酸合成功能增强。而脂肪酸含量的多少受到脂肪酸分解和合成代谢的影响，因而脂肪酸合成功能增强与患者脑内脂肪酸构成及含量变化之间的关系尚需进一步研究。

因此，以脂肪酸合成相关通路为出发点，来探索孤独症的发病机制及治疗靶点，具有理论和现实意义。然而，本研究只是在尸脑中的初步探索，具体功能还需要进一步的体内和体外实验论证。