半乳糖凝集素-3在大鼠精神分裂症发病机制中的作用☆

赵孟 王玉婷 彭安林 戢汉斌○☆

精神分裂症的发病机制假说众多，但其具体发病机制尚不明确，其中谷氨酸（glutamate，Glu）功能低下假说广受临床认可[1-2]。N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体缺陷可以诱导Glu认知系统功能紊乱，给予NMDA受体拮抗剂地卓西平马来酸盐（MK-801）可诱导动物产生类似精神分裂症的异常行为[3]。研究表明脑源性神经营养因子 （brain-derived neurtrophic factor，BDNF）、酪氨酸激酶受体 B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）功能异常与精神分裂症中谷氨酸功能低下密切相关[1,4]。炎症反应是导致海马神经元变性的重要因素，半乳糖凝集素3（Galectin-3）在神经退行性疾病中表达上调可诱导神经性炎症进而导致神经元病变，加剧中枢神经退行性疾病的进展[5-6]。Galectin-3在精神分裂症中表达情况及其参与调控海马BDNF/TrkB信号通路情况鲜有文献报道。本研究将采用MK-801建立Glu功能低下精神分裂症大鼠模型，通过水迷宫实验观察大鼠认知功能，并检测海马区Galectin-3、BDNF、TrkB蛋白及mRNA的水平，以探究Galectin-3在精神分裂症大鼠海马组织中的表达及可能对BDNF/TrkB调控的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级SD大鼠24只，体重（220±20）g，购买于华中科技大学实验动物中心，实验动物合格证号：NO.42009800001823。于室温、常规环境适应性喂养1周后，将所有大鼠按照取出顺序依次编为1～24号，单号为对照组（C组），双号为模型组（M组），每组12只。M组大鼠连续1周每日腹腔注射0.5 mg/kg MK-801（购自Sigma，货号：121917），建立精神分裂症大鼠模型[3,7]，C组注射等量生理盐水作为对照。

1.2 行为学实验M组末次给药后30 min对各组大鼠进行旷场实验和强迫游泳实验[3,8]，以评价精神分裂症模型。

1.2.1 旷场实验 抓住大鼠尾部提起将其放入5×5的 25格纸箱（100 cm×100 cm）中，观察 3 min内大鼠水平穿越格数（四爪均进入一个格子），每只大鼠实验结束清洗实验箱以便下一次评估。

1.2.2 强迫游泳实验 将大鼠置于一个透明容器内（高度为60 cm，直径为25 cm），保持水位在30 cm，水温（25±2）℃，记录大鼠5 min内游泳不动时间。不动时间定义为大鼠在水上漂浮没有四肢挣扎，头部露在水面以上，仅偶尔移动。

1.3 Morris水迷宫实验用于评估大鼠认知功能。水迷宫水池（直径160 cm，高50 cm）内水深25 cm，水温（20±2）℃。将水池等分划分4个象限，在第1象限内距离池壁35 cm处有1个直径12 cm、高22 cm的圆形黑色平台，位于水下3 cm。于第3象限将大鼠放入游泳池中，水迷宫上方连接的摄像机等系统（仪器型号：XR-XM101，上海欣软信息科技有限公司）可在电脑上同步显示并记录大鼠运动轨迹。建模时，每天训练2次，定位航行训练7 d，第8 d进行探针实验，即移除平台，观察大鼠逃避潜伏期和在靶象限穿越平台次数。大鼠放入水中直至到达终点平台的时间记录为逃避潜伏期，此期间穿过第1象限平台上方的次数为穿越平台次数。

1.4 免疫组化法检测大鼠脑组织海马Galectin-3和BDNF表达水迷宫探针实验后，用过量水合氯醛（1 g/kg）深度麻醉处死大鼠，断头冰下解剖大脑取脑组织。每组取6只大鼠脑组织经4%多聚甲醛固定，行石蜡包埋常规切片，于海马吻合位置连续冠状切片 （厚度 4 μm）。采用免疫组化法检测Galectin-3和BDNF表达：二甲苯、酒精处理脱蜡后，柠檬酸盐抗原修复1 h，H2O2孵育10 min，血清封闭 20 min，Galectin-3（1:500，Abcam）、BDNF（1:1000，Abcam）一抗4℃孵育过夜，洗脱孵育相应二抗（武汉安特捷有限公司），DAB显色15 min后封片，显微镜（DM2700，Leica，Germany）下观察脑组织海马区域Galectin-3和BDNF阳性表达情况。

1.5 免疫印迹法检测大鼠海马Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白表达冰下解剖剩余未行固定包埋的大鼠脑组织（n=6），取海马组织，以1:10的比例采用1%的苯甲磺酰氟（PMSF）裂解液进行匀浆提取蛋白样品，4℃下 10000×g离心 10 min后取上清，BCA试剂盒（武汉拜意尔公司）测定蛋白含量并调节蛋白浓度至相同，加入5×上样缓冲液沸水浴 10 min，-80℃保存备用。取 20 μL 样品上样，通过10%SDS-P聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-聚丙烯酰胺试剂盒，武汉拜意尔公司）分离蛋白，湿法转膜，脱脂奶粉封闭。分别加入Galectin-3、BDNF、TrkB和GAPDH抗体（1:3000，武汉安特捷有限公司）4℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育后，ECL法曝光显影获得蛋白条带，观察大鼠海马Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白表达。

1.6 RT-PCR检测大鼠海马组织Gelectin-3、BDNF和TrkB mRNA水平上述冰下解剖的大鼠脑组织（n=6），称取海马组织 40 mg，利用 TRIzol法提取总RNA，然后将1 μg总RNA通过cDNA Kit试剂盒进行反转录。RT-PCR在LightCycler@480（Roche公司）设备中进行，每个样品设置3个重复，并以GAPDH作为内参测定Gelectin-3、BDNF和TrkB mRNA水平。引物序列均由武汉拜意尔公司提供，见表1。反应条件：95℃预热10 min，94℃变性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 30 s，循环25次。定量PCR特异产物通过溶解曲线分析，以2-ΔΔCT表示相对基因表达变化。

表1RT-PCR引物序列

1.7 统计学方法采用SPSS 21.0进行数据统计分析。行为学和水迷宫实验数据、Gelectin-3、BDNF和TrkB蛋白及mRNA检测结果采用均数±标准差（±s）描述，组间差异采用独立样本t检验分析。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 行为学实验与水迷宫实验结果建模1周，M组大鼠水平穿越格数和C组比较减少（t=-9.319，P＜0.001），而游泳不动时间延长（t=6.948，P＜0.001）。两组大鼠经历同样次数的水迷宫训练后，M组逃避潜伏期时间高于 C 组（t=6.625，P＜0.001），穿越平台次数低于 C 组（t=-6.597，P＜0.001），差异有统计学意义。见表2。

表2大鼠行为学实验和水迷宫实验结果

2.2 大鼠海马组织免疫组化结果M组和C组海马区Galectin-3含量百分比分别为6.58%±0.71%和 1.71%±0.41%，M 组高于 C 组 （t=10.198，P=0.001）。M组和C组大鼠脑组织海马区域BDNF含量百分比为 0.92%±0.15%和 4.83%±0.41%，M组低于 C 组（t=-15.412，P＜0.001）。 见图 1。

2.3 大鼠海马组织Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白含量及mRNA水平与C组相比，M组海马区Galectin-3 蛋白（t=13.211，P＜0.001）及 mRNA 水平（t=5.820，P=0.004）增加，而 BDNF 及 TrkB 蛋白与mRNA的表达量下调，差异均有统计学意义。见图2与表3。

图1 大鼠海马区Galectin-3和BDNF表达免疫组化结果（×200）

图2 大鼠脑组织海马区Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白含量电泳图

3 讨论

早期研究表明，阻断NMDA受体可导致动物出现类似精神分裂症的表现，如认知缺陷、行为紊乱等[9]。本研究采用MK-801阻断NMDA受体建立精神分裂症模型，通过行为学实验如旷场实验和强迫游泳实验评估M组大鼠活动状态。和C组比较，M组大鼠自主活动量明显减少，游泳不动时间显著延长，说明MK-801干预后动物精神分裂症模型造模成功，这和于文娟等[3]、蔡菡等[8]的研究结果一致。此外，行为学水迷宫实验结果显示M组大鼠逃避潜伏期时间较C组明显延长，穿越平台次数也显著减少，这一结果表明MK-801能造成大鼠认知、学习、记忆能力下降，与占瑾琼等[2]、房茂胜等[7]的报道相符。

精神分裂症大鼠自主活动减少，认知、学习障碍与中枢神经系统海马神经元变性密切相关。既往研究证实，炎症反应是导致海马神经元变性的重要因素之一[10]。Galectin-3是半乳糖凝集素家族的致炎因子，在巨噬细胞活化、氧化应激、炎症反应等过程中发挥重要作用[11-12]。Galectin-3可与脑组织海马区的β-半乳糖异性结合形成β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ），应激状态下 Aβ 遭受炎性因子侵袭变性沉积，进而粘附于神经元轴索、树突及胶质细胞等，将加剧海马神经元变性[13]。本研究结果证实，与C组比较，M组大鼠海马区Galectin-3蛋白含量及mRNA水平显著上调。Galectin-3高表达会加剧大鼠海马区的炎症反应，介导炎症因子大量释放，同时Aβ过度沉积，诱导神经元轴索、树突及胶质细胞发生变性，突触传递异常。胶质细胞表面的神经元释放谷氨酸减少，突触传递效能下降，会导致BDNF/TrkB功能紊乱[14]。本研究结果提示，M组大鼠海马区域BDNF、TrkB蛋白含量及mRNA水平和C组比较显著降低，说明精神分裂症大鼠海马组织中BDNF/TrkB信号通路调节紊乱，这与WANG等[15]的研究结果相同，BDNF/TrkB功能异常加剧了海马区神经元病变，最终导致M组大鼠认知功能缺陷。

本研究给予MK-801阻断NMDA受体后，大鼠自主活动减少，学习能力变差，认知功能显著降低，并发现其海马组织中的致炎因子Galectin-3呈高表达，且BDNF/TrkB功能异常同步发生。精神分裂症大鼠BDNF/TrkB功能异常、海马神经元损伤可能与海马组织中Galectin-3过度表达有关。本研究不足之处在于缺乏干预组，Galectin-3在精神分裂症中是诱导BDNF/TrkB功能下调的原因，还是一种结果尚不清楚，因此Galectin-3在海马神经元损伤中的具体机制有待后续研究进一步探究。

表3 大鼠海马区Galectin-3、BDNF和TrkB蛋白及mRNA表达情况