游离DNA、TNF-α对多发伤合并骨折患者发生MODS的预测价值

盛 进，李子锋，黄 莉，张洋钒，王永剑

多发伤是由一种致病因素导致的两处或两处以上解剖部位或脏器损伤，且至少其中一处损伤会危及生命。多发伤患者受伤部位多、病情重、病死率居高不下，是危害人类生命健康的突出问题之一。患者受伤后机体快速变化，出现创伤后休克、低氧血症、炎症因子大量释放等，导致全身性炎症发生，继而引起细菌移位、肠源性内毒素血症，最终引发炎症“瀑布效应”，出现多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1-2]。

MODS 是多发伤患者死亡的主要原因，严重影响患者预后[3]。随着交通事故和高处坠落等高能量损伤的增多，多发伤合并骨折患者的比例也在逐年上升。对于此类患者，早期预测伤后MODS的风险，有助于提高康复率和生存率[4-5]。研究表明，人体血液循环中呈游离状态的DNA分子，其含量、类别或某些序列特征与多种疾病状态有关[6-7]，亦有学者通过联合检测外周血肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和游离DNA来评估多发伤患者的预后[8]。本研究回顾性分析多发伤合并骨折患者外周血游离DNA、TNF-α的变化趋势，旨在揭示多发伤合并骨折后上述指标与MODS 的相关性，为寻找MODS 的早期预测指标提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：①多发伤合并骨折；②受伤至入院时间不超过24 h；③受伤前无明显影响实验结果的疾病，如恶性肿瘤等；④临床资料完整。排除标准：①长期服药史；②治疗过程中因各种原因离院以及住院24 h内死亡的患者；③1个月内有感染病史或入院前合并感染者。

2016年5 月至2019年5月南方医科大学深圳医院共收治符合病例选择标准的109 例多发伤合并骨折患者。多发伤部位：腹部41例、胸部44例、头部39 例、泌尿系25 例；63 例合并有休克，46 例未合并休克。根据新型损伤严重程度评分（new injury severity score,NISS）[9]标准进行损伤严重度评分：评分≥25分者50例，16～25分者59例。

根据Marshall[10]提出的MODS诊断标准，将患者分为MODS 组和非MODS 组。其中MODS 组64 例，年龄15～79 岁，诊断为MODS 的时间为入院后2 d 至5 d 不等，发展为MODS 的平均时间为（2.8 ± 1.1）d；非MODS 组45 例，年龄18～68 岁。2组患者年龄、性别分布、伤因、骨折部位等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。另选取20 例同期健康体检志愿者作为对照组，其中男12例，女8例，年龄18～65岁。

1.2 指标检测方法

分别于入院即刻，入院后1、2、3 d采集多发伤合并骨折患者外周血5 mL，立即以3000 r/mL 离心操作后储存于–20℃冰箱中待检测。采用ABI ViiA7 实时荧光定量PCR 仪（Invitrogen 公司，美国），以磁珠法同步提取血浆DNA和重组质粒，试剂盒由上海浩源生物有限技术公司提供；双重荧光定量PCR技术检测血浆游离DNA拷贝数，试剂盒由日本Takara 公司提供。采用GC-911 型γ计数仪（科大创新股份有限公司中佳分公司），以放射免疫分析法测定TNF-α，试剂盒由北京科美东雅生物技术有限公司提供。以同法检测健康体检志愿者血液标本。

表1 两组多发伤合并骨折患者一般资料比较

1.3 统计方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用两独立样本t检验，3组比较采用方差分析，计数资料以例或率表示，比较采用卡方检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时相点游离DNA含量比较

入院时MODS 组、非MODS 组与健康组[（1430 ± 450）/L]外周血游离DNA 含量比较，差异有统计学意义（F=50.240，P＜0.01）。入院时两组患者外周血游离DNA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），入院后1、2、3 d MODS 组游离DNA含量高于非MODS组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组多发伤合并骨折患者外周血游离DNA含量比较（±s）

表2 两组多发伤合并骨折患者外周血游离DNA含量比较（±s）

注：MODS：多器官功能障碍综合征

组别MODS组非MODS组t值P值例数/例6445入院时6319±21375967±20962.5620.069入院后1 d 17680±36468280±36464.1350.036入院后2 d 24670±342812570±26914.9740.026入院后3 d 31697±512617630±26585.7920.014

2.2 各组不同时相点TNF-α水平比较

入院时MODS 组、非MODS 组以及健康组[（1.46±0.87）μg/L]TNF-α 含量比较，差异有统计学意义（F=10.951，P＜0.01）。入院时两组患者外周血TNF-α含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但入院后1、2、3 d 比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组多发伤合并骨折患者外周血TNF-α含量比较（±s，μg/L）

表3 两组多发伤合并骨折患者外周血TNF-α含量比较（±s，μg/L）

注：TNF：肿瘤坏死因子；MODS：多器官功能障碍综合征

组别MODS组非MODS组t值P值例数/例6445入院时2.22±0.762.19±0.292.1710.673入院后1 d 4.25±1.333.56±1.174.0920.042入院后2 d 5.68±1.034.21±1.154.9740.026入院后3 d 7.87±1.275.63±1.366.5850.012

2.3 游离DNA、TNF-α对MODS的预测价值

以健康组数据作为游离DNA、TNF-α的基准正常值，观察机体创伤后两者的动态变化。鉴于入院后1 d 机体创伤后应激反应对各项数据影响较小[11]，故采用入院后1 d的截断值来计算预测MODS 的灵敏度和特异度。当TNF-α升高（≥2.20 μg/L）、游离DNA升高（≥10000/L）两者同时存在时预测MODS 最准确，相对危险度（relative risk，RR）为6.00，特异性达99%。见表4。

表4 不同指标对MODS预测效率的比较

3 讨论

多发伤合并骨折的患者通常伤情复杂、严重、变化快，易漏诊，体内环境紊乱，休克率高，抵抗力低下，治疗难度高，需要积极治疗、坚强固定并辅以适当的功能锻炼等。但在早期治疗过程中由于处理时间较长，可能导致患者生理功能紊乱加重，加之颅脑、胸腹部等部位损伤，临床治疗较为困难；而多发伤患者本身常易继发MODS，预后较差。因此准确预测多发伤合并骨折患者发生MODS的可能性就显得尤为重要。

TNF-α是迄今为止发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一；同时也是炎症反应中最重要的因子，既是原发性介质，又是激发继发性炎症介质的趋化因子。学者们认为TNF-α的不当产生会导致患者病情恶化，其与创伤的晚期结局，如败血症、MODS、缺血性再灌注损伤等关系密切[12-13]。Svoboda 等[14]的研究结果显示，TNF-α和白介素（interleukin，IL）-6 似乎在多发伤中扮演重要角色，其在多发伤合并多器官衰竭晚期患者中的升高提示预后很差。本研究结果表明，TNF-α在入院后1 d 开始升高，随着时间延长，仍可继续升高。但如果单独作为MODS 的预测指标，其预测率及相关性较差，这与国外相关研究的结果一致[14-15]。对于骨折患者，Sun 等[16]的研究结果提示，TNF-α、IL-6 和IL-10 等细胞因子可作为老年髋关节骨折手术患者死亡及出现器官障碍等不良预后的独立预测因素；亦有学者观察开放性骨折患者外周血及伤口引流液中TNF-α的变化，结果提示该活性因子参与了伤后机体的病理生理过程，是监测开放性骨折患者病情危重程度及病程变化的良好指标[17]。

游离DNA目前广泛用于对肿瘤、胎前病变的检查与诊断，并不常用于创伤。对于其如何释放并进入循环，相关机制尚不清楚。有研究认为游离DNA 是预测创伤患者危险水平的潜在标记物[18-21]；亦有学者将其用于观察合并有MODS患者的病情进展以及对治疗效果的每日监测[22]。Campello 等[23]指出，游离DNA 水平与颅脑损伤严重程度相关，可用其水平变化来评估疾病严重程度；相关研究亦证实游离DNA在创伤的发生发展中起到一定作用[24-25]。付锐等[8]则认为，降钙素原、C 反应蛋白、游离DNA 可作为多发伤患者发生MODS 的预测指标，三者联合检测具有更高的灵敏度及特异度。在本研究中，游离DNA水平对于MODS的预测有较好的作用，入院后1 d即较健康组升高，随时间进展维持升高趋势，且MODS组患者的游离DNA 水平入院后各时相点均高于非MODS组。但作为单一指标，游离DNA对多发伤合并骨折患者并发MODS 的预测价值还有待商榷，其阳性预测率为80%；但与TNF-α联合使用后，阳性预测率和特异性均达到99%。

需要强调的是，TNF-α和游离DNA 表达与诸多因素有关，如炎症、肿瘤等，本研究在选择纳入患者时，严格排除了有肿瘤、炎症既往病史的患者，避免了上述因素对TNF-α和游离DNA 检测的干扰。此外，患者发生MODS的时间均在入院2 d后，因此入院时及入院后1 d TNF-α、游离DNA 含量测定与患者是否发生MODS 并无相关性，检测结果更加可靠。但本研究入样本较小，研究结果可能存在一定偏倚，需日后进一步积累病例，开展大样本多中心研究。

综上所述，游离DNA、TNF-α可作为预测多发伤合并骨折患者并发MODS 的指标，两者联合检测具有更高的灵敏度和特异性。