光遗传学在心脏电生理中的研究进展

熊永红，李 维，冷 燕，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

光遗传学是新近出现的一种生物学研究方法，其可以靶向在细胞或组织间表达光敏感蛋白。这些蛋白质最初被发现于微生物内，如藻类和古细菌等，但现已被分离、纯化和精制，可以在哺乳动物组织中表达[1]。特定的波长和强度可以诱导从微生物中提取的光敏感蛋白对非光敏细胞的光敏感性。且其诱导产生的离子通量能触发细胞活性，如动作电位沿轴突传播的电信号。光学控制动作电位产生和传播的能力在神经科学领域引起广泛关注[2]。这种新技术的最大优点在于通过利用基因工程方法以时空精确的方式调节神经元功能。基因工程方法能在特定神经元群体或所需亚细胞位置中表达视蛋白。此外，由于光遗传学能在毫秒时间尺度上精确控制光脉冲的宽度、频率和等待时间，所以可以用其来研究体内神经元编码的潜在行为。研究人员可以选择性地将光敏感蛋白转导至细胞亚群，使其对光照敏感，并通过光诱导触发细胞超极化或去极化来调节细胞、神经或组织的活性[3]。目前，光遗传学技术已被广泛运用于神经、癫痫、代谢性疾病、视网膜病、心肌电生理、急性肾损伤及疼痛等领域的研究[4- 6]。现就光遗传学在心脏电生理中的研究进展予以综述。

1 光遗传学概述

自1989年起，高分辨率相机技术以及几种电位和细胞内钙传感器的开发使得光学成像成为心脏研究的有价值工具。电传导、动作电位和钙瞬态形态可以在高时空分辨率下直接测量、量化和跟踪心肌细胞，这是传统电极技术无法比拟的[7]。

这种新兴技术最先在神经科学中被广泛应用，且越来越多的科研人员在心脏中研究其价值。目前，学者已在几个实验模型中报道了心脏制剂的光遗传起搏[7]。除节律控制外，光遗传学还被学者用于终止离体和体内啮齿动物心脏的心律失常，抑制和操纵心肌细胞单层中的转子并阐明心脏中心肌细胞和非心肌细胞亚群的功能[8- 9]。由于非接触式操作和高时空分辨率，全光学系统具有独特的高吞吐量控制能力，能够研究可激发介质中可能出现的复杂现象[10]。因此，光遗传学在心脏研究中发挥了关键作用，其为心脏的生理学和病理生理学研究提供了新方向，且一些独有的特征使其成为起搏和心律失常终止的潜在临床工具。

1.1基本原理 光遗传学主要利用光照改变细胞膜两侧的离子通透性，当神经元处于静息状态时，细胞膜两边存在电位差，即静息电位。静息电位的产生是由于膜内外各种离子的分布不均衡，以及细胞膜在不同情况下，对各种离子的通透性不同造成。当神经元受到刺激兴奋时，在静息电位的基础上发生一次扩布性电位变化，称为动作电位。如给神经元转入膜通道蛋白[视紫红质通道蛋白2(channelrhodopsin- 2,ChR2)或嗜盐菌紫质(natronomonas pharaonis halorhodopsin, NpHR)]。当用473 nm的蓝色激光照射时，ChR2通道蛋白的通道打开，允许阳离子(Na+)大量内流，产生动作电位，即让神经元处于兴奋状态。当用580 nm的黄色激光照射时，NpHR通道蛋白的通道打开，允许Cl-通过，使神经元一直处于静息电位，即让神经元保持静息状态[11]。

1.2激活神经元的通道蛋白 目前，已发现的激活神经元的通道蛋白包括ChR2及其突变体：ChR2最初在单细胞叶绿素莱茵衣藻中被发现，其在细胞膜上形成阳离子通道[12- 13]。当表达ChR2的细胞受到蓝光照射时，离子通道开放导致细胞去极化。ChR2的突变体ChR2(H134R)，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度比ChR2慢一倍。同时，突变体ChR2(E123A)具有4 ms的快速通道开放速度；ChR2(E123T/T159C)具有更大的光电流和更快的动力学变化。此外，ChR2的(E123T/H134R)突变体ChETA，使得神经元在激光刺激下可以发放的频率为200 Hz，而其他的ChR2通道蛋白只能达到40 Hz。C1V1是由ChR1及由团藻发现的VChR1组合在一起的通道蛋白，在红色激光刺激下打开通道[14]。

1.3抑制神经元活动的通道蛋白 抑制神经元活动的通道蛋白包括NpHR、古紫质等。其中，NpHR是第一个被发现的能有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下Cl-进入神经元内，从而抑制神经元活动[15]。NpHR在哺乳动物脑内表达时，其会聚集在内质网上表达，但不能在神经元细胞膜上高量聚集。古紫质是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，其能将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元处于超极化状态，从而保证神经元处于静息状态。与NpHR相比，当激光关闭时，古紫质从通道打开状态恢复为关闭状态。褐斑钩端螺旋体真菌视蛋白——蓝色激光激活的质子泵，其能使神经元保持超极化状态，从而保证神经元处于静息状态[14]。

2 光遗传学与心脏电生理

人的心脏含有数十亿个心肌细胞，每个心肌细胞(100 μm×20 μm×20 μm)均包含收缩单位，称为肌节；每个肌节之间以2 μm的距离排列，可通过光遗传学技术打开或关闭这些肌节从而改变心肌细胞特性[16]。光遗传学技术于2010年首次在斑马鱼和大鼠中用于心脏研究，在斑马鱼模型中ChR2和NpHR的转基因表达被用于研究心律[17]。且在该研究中，学者将光遗传学和光学显微镜结合起来，在斑马鱼发育过程中对心脏起搏器活动的起源进行空间映射，并发现光遗传学方法精准触发了可逆性节律紊乱。Bruegmann等[18]开发了一种表达ChR2- (H134R)的转基因小鼠胚胎干细胞系，并研究其在体外和体内的功能。结果发现，表达ChR2小鼠的心肌细胞和心脏组织通过光刺激诱导，导致钙离子释放去极化，从而产生了窦性心律失常和心脏异位起搏。

光遗传学提供了一种通过光与光门控离子通道的相互作用来控制可兴奋细胞电活动的方法。目前，光遗传学已被广泛应用于神经科学，但它很少被用于研究心脏病理生理学。然而，干扰心脏电活动的光学方法具有很多优点，特别是当完全利用光的时空特性时[19]。心肌细胞的功能障碍和心肌细胞间的相互作用与多种心血管疾病有关，包括心律失常和心力衰竭[20]。虽然大多数分子心脏病学研究已在体外研究了分离的心脏细胞，但由于技术困难仍未能阐明心脏的细胞网络。此外，考虑到电刺激无论是治疗还是研究均缺乏特异性，所以心脏光遗传学有望成为心律失常及心脏起搏治疗的替代方案，且由于其灵活性高侵袭性小，目前已成为研究心血管疾病的主要技术[21]。

2.1心脏起搏 自1950年起，心脏起搏治疗发展非常迅速。20世纪50年代后期，伴随右心室最先被起搏，起搏器引起的不同步风险已变得逐渐明显。双心室起搏虽然解决了不同步的问题，但仅对某些患者有益(主要由于左束支传导阻滞和持续时间≥150 ms，左心室功能下降)[22]。因此，研发一种新的干预措施对心脏停搏患者的治疗和预后非常重要。Bruegmann等[18]光诱导ChR2在小鼠体内对心肌细胞进行刺激，该方法能实现精确的心肌细胞局部刺激和心脏组织的持续去极化，从而恢复心脏节律。Ambrosi等[23]进一步研究开发了一种新方法，即使用光遗传学进行选择性细胞特异性兴奋，其中光学激发阈值可用治疗效率来表达。其主要用于测试心脏组织在治疗后结构功能关系，并恢复心肌细胞兴奋性。Yamamoto等[24]将兴奋性阳离子通道ChR2递送至大鼠脑中孤束核，刺激转导的神经元，结果显示膈神经元和交感神经元活动增加，平均动脉压和心率升高。Wengrowski等[25]使用转基因小鼠，使ChR2在小鼠儿茶酚胺能交感神经元中表达，给予光刺激，测量心律失常的发生率，并对心脏进行光学映射以检测动作电位持续时间和传导速度的变化，结果表明交感神经纤维的光刺激使得心脏更容易发生心律失常，且发病率和严重程度更高。可见，光学刺激增加了交感神经末梢的活动，增加了心肌收缩力和心率，缩短了动作电位持续时间，并增加了心脏异位起搏和心律失常。

虽然光遗传学运用于心脏的可行性已被证明，但目前的光学刺激技术无法对持续的心脏损伤及时做出反应。Scardigli等[26]开发了一个全光学平台，以实时调控心电活动。该方法可在房室传导阻滞后恢复正常电活动并恢复心室内正常传播，同时也可用于模拟穿过心室的重入电路。这种创新的光学方法的发展为实时光刺激在正常和异常条件下控制心律，提供了一个可行的方案。

2.2心脏除颤 心室颤动是心源性猝死的最常见原因[27]，其唯一治疗方法是通过提供强大的电击来进行除颤。除颤器的植入是一种使用广泛且有效的治疗方法；但由心脏周围可兴奋组织的侧支电信号通路激活可引起心前区疼痛，故迫切需要研究不需要高能量冲击以替代心室颤动的治疗方法。光遗传学是一种选择性刺激心脏的方法，是电除颤的理论替代方案，涉及在心脏中表达光敏离子通道(通过基因或细胞疗法)和心脏表面的照射(通过植入的LED灯)以引发光诱导的激活。与目前临床使用的电除颤仪相比，光遗传学技术除颤使用的能量更少，避免了心肌细胞的直接损伤；且特异性靶向技术可以避免刺激周围神经肌肉引起的疼痛不适[28]。

Karathanos等[29]使用基于生物物理的人体心室模型来确定光刺激疗法是否可以终止心室颤动，并确定光敏离子通道特性和照明配置的哪些组合是匹配且有效的。结果表明，当大部分(>16.6%)心室组织被足够明亮的光直接刺激在未偶联的细胞中诱导动作电位时，除颤成功。Nyns等[8]的研究表明，对进行光遗传学转染的成年大鼠心脏进行简单的局部心外膜照射，可以利用光诱导终止室性心律失常。

2.3室性心律失常 目前，室性心律失常是一个日益严重的问题，其发病率和死亡率很高[30]。虽然室性心律失常的治疗方法取得了重大进展，但目前其治疗方案仍不理想。即药物治疗没有明显效果，而导管消融可能导致不可逆的并发症。电击疗法可有效终止室性心律失常，并已显示可降低死亡率，如植入式心脏除颤器。然而，上述装置所传递的高压电击会造成皮肤创伤，且还与严重的疼痛、焦虑和抑郁、心肌组织损伤有关[31]。光遗传学是一种新兴的生物技术，其使用光门控离子通道以特定、可逆和无损伤的方式电调节细胞、组织和器官。因此，光遗传学可能为生物学和疼痛的发展提供新思路。研究表明，心脏光遗传学允许整个心脏的光学起搏和细胞培养中光诱导的心律失常终止[32]。现阶段主要研究成年大鼠心脏的光遗传学修饰是否能够实现光介导终止室性心律失常。可见，光遗传学已成为治疗心律失常的潜在替代方案。Boyle等[33]通过纤维化患者心房核磁扫描重建的计算模型来探索光遗传终止房性心动过速的可行性，并比较了分布式和靶向式两种不同照射的区别。结果显示，在成功将光敏感蛋白基因ChR2递送到心肌细胞时，模拟显示持续长于房性心动过速周期的目标光脉冲可有效终止房性心动过速。

Yu等[34]在研究中以腺相关病毒为载体将古紫质T递送至左星状神经节。结果显示，运用发光二极管照明显著抑制了左侧星状神经节功能、左侧星状神经节的神经活动及改变心率变异性的交感神经指数和左心室有效不应期；30 min的光照进一步增强了光遗传学组的这些变化，且所有这些变化在照明关闭后2 h内恢复到基线。此外，在光遗传学组中通过光照降低了缺血诱导的室性心律失常的发生频率。以上研究表明，光遗传调节可以可逆地抑制左侧星状神经节的神经活动，从而增加心肌电生理稳定性并防止心肌缺血诱导的室性心律失常。Yu等[34]研究的另一个重要发现为光遗传学可通过心外膜表面的一小块区域成功终止室性心律失常。因此，可以预想通过将目的光源聚焦在相对较小的心脏表面来治疗心律失常。

3 小 结

在心脏疾病的诊疗和预防中，与常规电除颤和药物治疗方法相比，光遗传学技术有显著优势。在心脏研究中，光遗传学方法已用于解释体外和体内细胞的相互作用。除心脏起搏和心律失常外，光遗传学方法还可用于细胞水平研究，使研究人员能够获得组织水平和细胞水平的基本特性[35]。鉴于该领域在临床的应用前景，光遗传学可能会在心脏学科的预防和治疗上有突破性进展。虽然光遗传学目前仍有很多技术问题待解决，但光遗传学是一条创新性道路，其能为治疗心血管疾病，特别是为替代电除颤研究提供新方法和思路。