外泌体在阿尔茨海默病发病机制和诊疗中的作用

张 锐，王永祥，杜怡峰※

(1.聊城市人民医院神经内科，山东 聊城 252000； 2.山东大学附属省立医院神经内科，济南 250021)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种与人类年龄有关的进行性退行性疾病，其典型临床特征主要包括意识障碍、认知功能障碍、记忆力下降、生活能力下降直至活动能力丧失。截至目前，全球有3 000余万AD患者，且大多数患者是散发的，只有5%的患者早期发病与遗传因素有关[1]。世界卫生组织预计，到2050年AD患者将达1.15亿人。曾新颖等[2]在1990—2016年中国及省级行政区疾病负担报告中指出：2005—2016年我国AD增幅为57.8%。因为AD病因复杂，起病隐匿，往往不能被及时发现，同时针对AD治疗的药物研究均以失败告终。2019年初，Biogen和Eisai两家制药公司又宣布停止AD药物研究的ENGAGE和EMERGE Ⅲ期临床试验。所以目前缺乏治疗AD的积极有效措施，这不仅增加了社会和家庭的压力，也使其成为不可忽视的重大疾病。外泌体是1983年科学家在研究网织红细胞时发现的，其最初被认为是细胞处理不需要物质的一种细胞机制[3]，到1987年外泌体才有了比较明确的定义。研究证实，特殊分泌囊泡——外泌体不但可以参加组织与细胞之间的通信，而且能广泛参与生理进程和病理的传播，因此备受重视[4]。现就外泌体在AD发病机制和诊疗中的作用予以综述。

1 外泌体概述及其生物学特性

外泌体实质上属于一种胞外囊泡，其直径为40～200 nm，由核内体通过逆行出芽的方式内陷形成，随之出现多囊泡体，多囊泡体内含有大量腔内囊泡。多囊泡体不仅可以和胞膜融合将其中的腔内囊泡释放到细胞外环境，还能结合溶酶体来降解其内容物，或继续留在细胞内，形成Weibel- Palade小体、黑色素小体等特殊的细胞器。内源性蛋白质被分拣进入腔内囊泡的机制有两种，即内涵体分选复合物依赖型和非依赖型。其中，细胞因子(内涵体分选复合物)的组件肿瘤易感基因101和ALG- 2相互作用蛋白X、鞘脂神经酰胺在蛋白质的分选过程中均起控制作用。此外，在缺乏内涵体分选复合物时也有生成腔内囊泡的情况，所以推断目前还有不清楚的产生腔内囊泡方式存在[5]。

外泌体存在于各种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液、母乳等，并携带有不同的脂质、蛋白质、DNA、微RNAs(microRNAs，miRNAs)、信使RNA、长链非编码RNA及某些病毒来源的遗传物质[6]。在人体多种病理生理条件下的外泌体亚群均已确定[7- 8]，其携带的独特生物学内容物可以代表原始细胞源的生理和病理状态。在神经系统里，神经干细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元均能分泌外泌体，且在脑脊液中已发现上述来源的外泌体[9]。

外泌体作为神经细胞通信的信使，不仅能在一定程度上支持神经细胞，还能为神经细胞生理功能稳定提供保障，同时对中枢神经系统平衡发挥调节作用[10]。其作用方式包括直接作用于受体细胞；将特异性传染颗粒或功能性蛋白质传递给受体细胞；直接在细胞间进行受体转移等。在生理机制下，间充质细胞来源的外泌体有利于轴突的发育，星形胶质细胞来源的外泌体可以选择性分泌神经保护物质，促进细胞存活。在病理作用下，一些外泌体又可能具有传播或清除毒性物质的作用，如AD中的β淀粉样蛋白(β- amyloid protein，Aβ)和Tau蛋白，以及亨廷顿病中的多聚谷氨酰胺蛋白和大量重复的RNA，在神经退行性疾病中，蛋白质突变导致错误分选或错误折叠，同时Aβ和Tau蛋白降解途径受阻，造成外泌体携带错误折叠或突变后的有毒蛋白质扩散，推动退行性神经疾病的形成并不断演化[11]。

2 外泌体参与AD的发病机制

外泌体在AD病理过程中的作用包括参与Aβ的代谢、传播、聚集、清除以及对Tau蛋白的传播和转运，这早在2006年就已被Rajendran等[12]证实。除了Aβ外，神经退行性疾病也会受磷酸化Tau蛋白的影响。作为脑微管相关蛋白，Tau蛋白能直接结合微管并调节其结构和功能[13]。Tau蛋白在磷酸化过度条件下会将神经原纤维缠结触发，并参与神经退行性疾病的扩散。Asai等[14]对两种Tau蛋白小鼠模型(AAV- Tau蛋白注射模型和转基因PS19模型)进行研究发现，减少小胶质细胞可以抑制Tau蛋白的传播，且抑制外泌体的合成也可以减少Tau蛋白的传播，可见小胶质细胞来源的外泌体是在神经细胞中传播Tau蛋白的重要工具。此外，与外泌体相关的磷酸化Tau蛋白也可分别从AD患者血液和脑脊液中分离出来[15]。Polanco等[16]实验表明，从小鼠脑细胞外间隙分离的外泌体样囊泡中的Tau蛋白所占比例较高，且其已出现一定程度的磷酸化。这表明，外泌体参与了Tau蛋白的运输和传播。因此，外泌体与淀粉样物质和Tau蛋白传播有关是造成AD细胞毒性和神经病变蔓延的机制之一[17]。且其他神经退行性疾病(帕金森病)的研究也得出类似结论[18]。Sarkar等[19]在AD实验小鼠和AD患者的相关脑区内均发现miR- 34a高表达，邻近神经元细胞摄取高表达miR- 34a的外泌体后，整合素- 金属蛋白酶10、沉默信息调节因子2相关酶1基因被miR- 34a靶向阻断，Aβ出现并沉积。

也有研究认为，外泌体在Aβ的病理和功能影响中也有有益作用。An等[20]和Falker等[21]的研究显示，小鼠神经母细胞瘤细胞分泌的外泌体可以消除AD患者脑中Aβ斑块对突触可塑性的破坏。Yuyama等[22]认为，细胞外的外泌体(神经元分泌)对Aβ构象产生诱导作用，使Aβ向淀粉样纤维(无毒)转变，且对小胶质细胞摄取Aβ有促进作用，细胞内的Aβ则被外泌体运输到溶酶体进行降解。在后续研究中，他们将外泌体注入AD转基因小鼠的脑部发现，注入的外泌体可以诱导Aβ被小胶质细胞吞噬[23]。此外，在APP/PS1大鼠模型认知功能改善的实验中，经过缺氧处理的间充质干细胞分泌的外泌体中的促炎因子(肿瘤坏死因子- α、白细胞介素- 1)水平下降，但抗炎因子(白细胞介素- 4、白细胞介素- 10)水平升高，说明外泌体可通过抑制炎症反应来减缓AD发展[24]。

可见，外泌体在AD中可能具有“双面性”，既可促进淀粉样物质、Tau蛋白等毒性物质的传播，也可减轻病理性损伤。因此，由各种细胞分泌的功能不一的外泌体可能对机体的代谢平衡起维持和调节作用，这种动态平衡的失衡导致病理状态的出现。

3 外泌体在AD诊断中的价值

作为神经性退行性进展疾病之一，临床已采用影像学和神经心理学测试来辅助诊断AD，但大多数AD患者前阶段可能是无症状的，且这个阶段最长可达17年[25]。目前，脑脊液内的Tau蛋白、Aβ是临床诊断AD的主要标志物，由于在AD患者脑脊液/血浆中提取的外泌体中发现了与疾病相关的蛋白，所以外泌体在临床已被作为AD的生物标志物之一。Fiandaca等[15]通过对血浆中神经细胞来源的外泌体进行研究发现，外泌体中的p- T181- tau、p- S396- tau和Aβ1～42在临床发病前数年即可对AD做出预测。此外，可以通过检测外泌体中Aβ的表达水平监测AD的发病情况。

Goetzl等[26]对28名正常人、16例额颞叶痴呆患者和12例AD患者进行分析发现，只有AD患者的突触素1和生长相关蛋白43水平下降。这证实，对于AD可能可将神经细胞外泌体突触蛋白作为其临床预测指标。

Vesiclepedia数据库列出了在33种外泌体中发现的两万多种信使RNAs和近五千种 miRNAs，包括病毒RNA、转运RNA片段、小核RNA、核仁小RNA、Piwi互作RNA、非编码RNAs等[27]，这些被称为外泌体源性RNAs可成为AD诊断的新标志物。

外周血中外泌体携带的miRNAs因充分保有源神经细胞分泌时的内容物而逐渐成为新的AD生物诊断标志物[28]。Lugli等[29]采集了35例AD患者的血清提取其外泌体中的miRNAs，并筛选出20个表现有显著差异的miRNAs，其中miR- 342- 3p被认为是独立诊断AD的生物标志物。另一项试验将AD 患者、轻度认知障碍患者与健康对照者血清中的外泌体进行比较发现，14种miRNAs表达上调，3种miRNAs(miR- 1306- 5p、 miR- 342- 3p、miR- 15b- 3p)表达下调[30]。Yang等[31]在107例AD患者与正常对照者的对照试验中发现，血清外泌体中的miR- 135a和miR- 384表达上调，但miR- 193b的表达下调。Riancho等[32]报道，AD患者脑脊液外泌体源性RNAs表达谱中15个miRNAs发生明显变化，其中正常对照者50%与70%的样品中分别检测出miR- 9- 5p与miR- 598，而所有AD患者样品中均未检测到，提示miR- 9- 5p与 miR- 598可能是AD潜在的标记分子。可见，miRNAs作为诊断生物标志物具有广阔的发展空间。

脑脊液、血液、尿液、血浆、血清中均可以提取出miRNAs，其提取可通过实时荧光定量聚合酶链反应、基因芯片、深度测序技术完成，而作为AD标志物循环中的miRNAs可通过新一代高通量测序技术识别。

4 外泌体与AD的治疗

研究表明，细胞外囊泡的关键特征是它们可以在中枢神经系统和外周循环之间传播，其既可被当成清除有毒蛋白质的平台，也可以绕开血脑屏障，故使得改良的细胞外囊泡可成为独特的药物输送方式[33]。外泌体具有的基本特征包括：①外泌体本身属于一种膜性囊泡(来自于细胞分泌)，这使得它们具有生物运输载体的特性[34]；②外泌体能在相邻细胞或器官之间运输特有的内容物；③外泌体可以有效地穿透血管屏障[35]。且外泌体作为治疗方式也是安全可控的：①外泌体不能够自我复制，不会像瘤细胞样转移；②外泌体是一种脂质囊泡，其可以运载人工合成的内容物，在生物工程中可以进行质量和剂量控制；③治疗用的外泌体可以取自患者自身，从而避免了潜在的免疫并发症。这些特性使得外泌体可成为一种治疗神经系统疾病的新方式、新载体。

神经元渐进性丢失，神经原纤维缠结，Aβ沉积过度，这是AD具有的典型特征。脑啡肽酶能降解Aβ的沉积，有试验利用间充质干细胞分泌含有脑啡肽酶的外泌体，通过核外递送的方式运输至大脑发现，其可以减少Aβ积累，减轻AD的症状[36]。将这种方式运用于靶向治疗，已在小鼠模型中进行了实验。Katsuda等[36]试验发现, 脂肪干细胞来源的外泌体中存在肾胰岛素残基溶酶的高表达, 而这种酶可有效降低大脑中Aβ的水平，进而减少Aβ积累。

β- 淀粉样前体蛋白裂解酶1隶属于蛋白酶家族，其可有效裂解淀粉样前体蛋白N端，从而造成Aβ积累。Alvarez- Erviti等[37]利用电穿孔法将载有干扰小RNA的树突状细胞来源的外泌体通过血脑屏障输送至大脑，结果造成信使RNA和β- 淀粉样前体蛋白裂解酶1呈剂量依赖性显著下调，从而减少Aβ积累，缓解了AD的病理进程。

Wang等[38]发现，短发夹RNA介导的前列腺凋亡反应蛋白- 4下调可以使凋亡减轻，前列腺凋亡反应蛋白- 4是一个对鞘脂神经酰胺敏感的蛋白。淀粉样肽可以诱导富含前列腺凋亡反应蛋白- 4/C18神经酰胺的外泌体分泌，但在缺乏中性鞘磷脂酶2的星形胶质细胞中没有观察到凋亡，说明由中性鞘磷脂酶2产生的神经酰胺对于细胞凋亡很重要，故认为中性鞘磷脂酶2是AD的潜在药物治疗靶点。后续试验也证明，通过药物抑制中性鞘磷脂酶2，AD患者淀粉样斑块在脑部的沉积量下降[38]。此外，通过增加5XFAD小鼠血清中的神经酰胺抗体，可以减少Aβ沉积和降低血清中的外泌体水平[39]。

实验表明，有氧运动训练历时150 d后的转基因组小鼠(APP/PS1)认知功能显著超过对照组；其脑内的Aβ淀粉样斑块显著减少，Aβ代谢关键酶β- 淀粉样前体蛋白裂解酶1蛋白水平显著下降，ADAM10蛋白水平明显提高，提示运动训练可能促进了脑内Aβ的代谢[40]。另外，小鼠脑内多囊泡体水平明显升高，提示运动训练可能促进外泌体的产生和释放[40]。

5 小 结

外泌体的生物利用度及其内在的生物特性使得它们成为很有潜力的治疗方式，外泌体进入细胞有多种路径,每一种进入方式均需评估其是否是最有效的一种方式，而外泌体可以被设计以“编码”的方式进入[41]。但利用外泌体进行生物治疗仍存在很多问题，如外泌体的承载能力及其内容物的半衰期需要明确；要从药理学的方面考虑外泌体的剂量和生物学分布；外泌体在受体细胞的摄取动力学；外泌体的治疗性递送是否需要囊泡表面有配体，以提高靶目标的结合、增加递送的成功率等。未来对外泌体生物学的深入研究，将为AD的治疗提供新思路。