拉曼光谱技术在药物晶型研究中应用进展*

周健，杨世颖，靳桂民，张丽，吕扬

(北京协和医学院中国医学科学院药物研究所晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

拉曼光谱法是基于拉曼散射原理[1]的分子振动光谱，是研究化合物分子受到光照射后所产生的散射光、入射光的能级差与化合物振动频率、转动频率相互关系的分析方法，通过测量拉曼散射光中特定谱成分的相对强弱，可以获得被测分子或者体系的相关信息[2-3]。拉曼光谱技术以其自身在物质定性和定量分析中所显示出的优越性，被广泛应用于药物、食品、化学、生物等多个领域[4-5]。在药物研究领域，拉曼光谱可用于单一组分的化合物的定性鉴别，也可用于中药材或药物制剂等复杂成分的定性或定量研究[6-10]。拉曼光谱结合多种化学计量法可用于表征未知化合物，确定其成分并获得有关其结构的信息，也可实现定量分析目的[11-13]。此外，拉曼光谱在药物动态过程变化的研究中也有较多应用，如利用拉曼光谱了解药物溶出过程中早期变化[14]；作为过程分析技术的研究工具，用于在线测定药物活性成分的浓度和聚合物-药物在药物热熔出过程中的变化[15]。拉曼光谱技术在药物逆向工程[16]的研究中也发挥着重要的作用。

近年来，随着科研人员对拉曼光谱认识的深入以及拉曼光谱仪器发展的进步(分辨率提高等)，拉曼光谱越来越多地应用于药物不同晶型物质间细微差别的区分[17]。《欧洲药典》[18]、《英国药典》[19]、《中华人民共和国药典》[20]均已将拉曼光谱技术列为药物晶型研究常用的检测分析方法。在药物晶型研究的常用检测分析方法中，仅有单晶X射线衍射分析可以提供晶型物质全面的定性定量信息，但由于该方法需要得到满足衍射实验的单晶体，从而使得其在应用上受到一定限制。更多情况下，晶型研究需要采用多种分析方法从不同角度与不同层面共同表征，如粉末X射线衍射方法提供晶型物质的分子排列规律信息，热分析方法给出不同晶型物质的热力学差异与含有结晶水或结晶溶剂等情况，光谱方法则通过反映分子基团的振动差异而在不同晶型物质间的分子作用力分析方面具有更多优势。作为一种光谱学方法，拉曼光谱技术在药物的多晶型研究方面具有独特的优势，具体表现在：①拉曼是物质的指纹光谱[21]，拉曼光谱技术以其自身特有的拉曼信号响应，定性角度可以得到物质结构、晶型等信息；②虽然拉曼光谱与红外光谱一样，反映化合物分子结构中基团的振动信息，但红外光谱源于分子偶极距变化，拉曼光谱则由分子极化率变化产生。因此，红外吸收弱的峰在拉曼光谱中很强，可以与红外光谱形成有力互补；③拉曼光谱在检测低频振动方面具有优越性，甚至可检测到分子的晶格振动；④拉曼光谱谱带的强度与待测物浓度的关系遵守朗伯-比尔定律，可以通过光谱校正得到浓度的分布，为药物晶型定量分析提供可行方法；⑤基于拉曼成像技术的原理，同时将共聚焦显微技术与激光拉曼技术相结合，即时的图谱结果可通过多种数学运算转换为样品组分图像[16]，这一技术优势也为运用拉曼光谱技术进行多晶型组分定量研究，特别是对于制剂中晶型问题的研究奠定基础；⑥拉曼光谱技术无需样品制备，属对样品无损的原位检测技术。鉴于这些独特的优势，拉曼光谱在药物晶型的研究中日益受到广泛关注和应用[16，22-24]。笔者在本文聚焦拉曼光谱技术在药物晶型研究中的应用，对国内外相关文献进行归纳与总结，系统综述拉曼光谱在药物晶型定性、定量、动态过程研究中的进展，旨在为相关领域研究人员提供思路与参考。

1 拉曼光谱用于药物晶型定性研究

药物的不同晶型物质之间具有相同的化合物结构，但是不同晶型物质中药物分子具有不同的分子排列规律、分子构型构象或不同的结晶溶剂种类与数量，由此具有不同的分子内或分子间作用力，这些晶型间的差异反映在拉曼光谱中，往往体现在图谱的峰数量或峰裂分、峰位置以及峰强度或峰形拓扑等方面。

杨梁等[25]在对盐酸林可霉素两种晶型进行单晶X衍射分析的基础上，开展该两种晶型中不同的分子构象对两种单晶拉曼光谱行为影响的研究。通过对比分析可发现，林可霉素两种晶型的拉曼光谱图谱存在的主要区别在于，晶型Ⅰ在1667 cm-1处有1个明锐的的散射峰；晶型Ⅱ在相同的位置则分裂为1687 cm-1和1667 cm-1处的2个毗邻相连的散射峰；晶型Ⅰ在1151 cm-1和1143 cm-1处顶部分裂为2个散射峰；晶型Ⅱ在1146 cm-1处的散射峰则为顶部形成平台的单峰。该实验结果证明不同晶型在拉曼图谱中特征峰的裂分行为也可以作为定性区分的依据。同时实验结果表明，在已知单晶结构的基础上，拉曼光谱给出的信息可以更准确地确定分子结构中相关特征基团及晶体结构中氢键的振动信息。

拉米夫定(lamivudine) 是临床上用于治疗乙型肝炎和艾滋病的核苷类药物，据文献报道，拉米夫定有两种晶型，晶型Ⅱ流动性好，且在水中的溶解度高于晶型Ⅰ，为药用晶型。叶晓霞等[22]以拉米夫定中的杂质晶型——晶型Ⅰ为分析目标，探讨晶型药物中杂质晶型的定量测定方法的过程中，通过拉曼光谱对拉米夫定的两种晶型进行有效的区分。通过拉曼图谱的对比分析，发现在扫描范围3500～200 cm-1内，晶型Ⅰ在697和312 cm-1有明显的散射峰，晶型Ⅱ在916和851 cm-1有明显的散射峰。在利用拉曼光谱对拉米夫定的两种晶型进行定性区分的实验中，两种晶型特征峰位置的不同成为定性鉴别的主要依据。

尼莫地平是临床应用广泛的钙通道阻滞剂类降压药。焦凌泰等[26]通过快速去溶剂法制备尼莫地平A、B两种晶型。对两种晶型的样品进行拉曼光谱分析。对得到的拉曼图谱进行分析比较，发现两种晶型样品在4000～200 cm-1内，主要区别在于2种晶型在部分峰强度上存在差异，其中在1352 cm-1处主强峰和1645 cm-1处的次强峰的峰强度之比，晶A型两个强峰强度之比为10 192：10 174，晶B型的强峰比次强峰峰强度之比为8274：6411。根据峰强度不同，可有效鉴别尼莫地平两种晶型。

拉曼光谱技术除了对原料药的不同晶型实现定性研究，也可用于对片剂中药物活性成分的不同晶型进行定性研究。西尼地平是一种新型二氢吡啶(dihydropyridine，DHP)类钙通道拮抗药，具有长时间持续扩张血管的作用。石云峰等[27]对制得的西尼地平α和β两种晶型进行拉曼光谱检测，通过观察图谱可发现西尼地平α晶型和β晶型的拉曼峰有差异。此外，通过随机取点进行面和深度扫描，对三家企业的市售西尼地平片和原研企业的西尼地平片进行拉曼光谱检测，初步判定四种片剂中西尼地平存在的晶型状态。

杨伟峰等[28]通过拉曼光谱技术对硫酸氢氯吡格雷原料药和对照品进行表征，并得到两种晶型的拉曼对照图谱。随后通过拉曼光谱对来自11个厂家的硫酸氢氯吡格雷片进行表征，用OPUS软件聚类分析法判别出国内外不同厂家硫酸氢氯吡格雷片的晶型，再通过建立定性鉴别模型鉴别未知样品。聚类分析结果表明8批硫酸氢氯吡格雷片均属于晶型Ⅰ，3批硫酸氢氯吡格雷片均属于晶型Ⅱ，采用一阶导数法和矢量归一化法处理图谱，用因子分析法计算，选择500～743、900～1000、1400～1650 cm-1谱段建立定性模型，经验证，该模型的灵敏度、专属性、阴性预报性和检出效率均良好。石云峰等[29]采用相似的方法对卡马西平4种晶型，进行拉曼光谱表征，并建立定性鉴别模型，对4批卡马西平片剂中晶型种类实现的检测。

除了上述利用拉曼光谱技术对片剂中药物活性成分的不同晶型进行定性研究，拉曼光谱也可以用来对药物中API的晶态和无定形实现定性检测。NAKAMOTO等[30]选用乙琥胺(ESM)被选作模型制剂的API。固态乙琥胺通过加热熔化和吸附在水合二氧化硅上来实现从晶态到无定形的转变。将这一过程作为模型，通过拉曼微光谱的对样品中晶态和无定形的分布完成检测。实验结果表明，拉曼光谱特征峰值的差异可用来确认两种形式的乙琥胺，同时还证实拉曼微光谱可用于在固体制剂表面表征晶态和无定形。

2 拉曼光谱用于药物晶型定量研究

近年来，随着拉曼光谱技术的探索不断深入，拉曼光谱在药物晶型中的应用也从定性鉴别逐步扩大到多元晶型混合物定量研究。利用拉曼光谱对多元晶型混合物进行定量，主要通过建立标准曲线及结合化学计量学方法进行。

墨玉欣[31]通过标准曲线建立的方法，利用在线拉曼光谱技术对L-谷氨酸水溶液及两种混合晶型的悬浊液实现定量分析。将两种晶型物质采用等量倍增法混匀，制成分别含晶型Ⅰ 0%，5%，10%，30%，50%，75%，90%和100%的线性混合物。分别测定线性混合物的拉曼光谱，以强度比值为纵坐标，浓度C为横坐标，进行线性回归，得线性方程。

拉曼光谱结合多种化学计量学的方法可以对研究对象实现较好的定量研究，常用的方法包括主成分分析(PCA)，聚类分析，直接经典最小二乘法(DCLS)和多变量分析曲线分辨率(MCR)等[32-34]。在对多元晶型混合物的定量中，偏最小二乘法(PLS)和主成分回归(PCR)分析法的应用最为广泛。STRACHAN等[35]和MARCO等[36]均以卡马西平为例，对其多晶型混合物进行定量分析。前者利用拉曼光谱结合PLS和PCR对卡马西平多晶型混合物进行定量分析，研究结果表明，拉曼光谱数据的PLS和PCR为多晶型的定量分析提供一种灵敏的方法，LD通常<1%。后者则利用拉曼光谱结合PLS完成了对卡马西平三元晶型混合物的定量检测，使用平均光谱来建立校准模型，并使用额外的样品组来评估模型，PLS模型给出预测的均方根误差为6.2%。LI等[37]对磺胺甲嘧啶(SMZ)二元多晶型混合物中的杂质晶型进行定量测定，运用PLS回归来对收集到的SMZ两种晶型混合物的拉曼光谱建立标准校正模型。HU等[38]通过使用拉曼光谱联合衰减全反射-红外光谱(ATR-IR)和近红外光谱(NIR)，并结合PLS完成了对磺胺噻唑3种晶型混合物的定量分析。KACHRIMANIS等[39]通过拉曼光谱结合PLS回归分析方法对扑热息痛的多晶型混合物实现了定量，特别要提到的是，该实验采用3种不同的预处理算法，即正交信号校正(OSC)，标准正常变量变换(SNV)和乘法散射校正(MSC)以消除由样品制备和样品不均匀性引起的影响。实验发现经过OSC算法预处理后得到的光谱，可以得到具有出色预测性能且更为简单的PLS模型。NÉMET等[40]利用拉曼光谱技术结合经典最小二乘(CLS)，主成分回归(PCR)和PLS法在不同光谱范围下，通过不同路径长度类型和光谱预处理步骤对法莫替丁的多晶型混合物进行了测试，同时还对比在该项检测中拉曼光谱技术相较PXRD所表现出来的优势。

利用拉曼光谱结合化学计量法作为研究手段，LIPIAINEN等[41]采用吡罗昔康作为研究对象，对比低频和中频拉曼光谱在药物晶型定量中的检测能力。吡罗昔康多晶型和水合物在低频和中频区域中都显示出明显的光谱差异。在低频和中频拉曼光谱中，两个特征区域都提供了适合结合PLS来预测混合物组成的定量模型。实验结果表明，低频数据给出更好的定量模型，低频拉曼分析的更好性能归因于固态形式之间较大的光谱差异和较高的信噪比。

除了可以开展对混晶物质的晶型定量研究外，拉曼光谱技术也可以用于对制剂中药物活性成分的晶型定量。阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium，ATC)是最畅销的降脂制剂Lipitor®的活性药物成分(active pharmaceutical ingredient，API)。据报道ATC现存在12种晶型。SKORDA等[42]利用拉曼光谱技术对ATC片剂中晶型Ⅷ进行定量，选择1602 cm-1作为合适片剂ATC峰值，对于赋形剂使用359 cm-1。实验发现，与红外光谱和X射线粉末衍射定量相比，拉曼光谱表现出更低的检测限，并构建标准模型。HENNIGAN等[43]通过拉曼光谱技术结合化学计量法，并通过了MSC和Savitzky-Golay二阶导数组合的方法对光谱图进行预处理，最后成功对吡拉西坦片剂中杂质晶型的含量实现测定。PRATIWI等[44]将拉曼光谱的主成分分析方法(PCA)应用于两种多晶型物质所组成的二元混合物的定量检测中。实验以盐酸雷尼替丁的晶型Ⅰ和晶型Ⅱ为研究对象，通过将一种晶型添加到另一种晶型的粉末片剂中而制备二元混合物。再通过多元线性回归预测二元混合物中两种晶型的定量限和检测限来建立定量校准模型。研究表明拉曼光谱数据的PCA分析为定量分析商品片剂中药物多晶型杂质，提供一种灵敏的方法。

3 拉曼光谱用于药物晶型动态过程分析

在药物晶型问题的研究中，拉曼光谱除了可对药物晶型进行定性与定量分析，利用其分析药物晶型的动态过程问题也成为时下研究的一大热点。一方面拉曼光谱是研究晶型动态转化的有力手段，另一方面在过程控制中该项技术有应用优势。在科研与生产中常用到的药物晶型动态过程分析的方法主要有[45]：在线红外技术、在线太赫兹技术、在线粉末X射线衍射技术以及热台偏光显微镜等。而拉曼光谱技术在其中受到大家广泛关注，主要在于大多数有机物都具备很好的拉曼吸收光谱，拉曼光谱适用于水溶液体系，分辨率更高。但是应用拉曼光谱技术在对药物晶型动态过程进行研究的时候，会出现由于溶剂的拉曼散射很强，很难从光谱数据中得出原料药的拉曼光谱等问题。这也提示在研究过程中应注意对方法进行合理的调整[45]。

在利用拉曼光谱对晶型转变过程的动态研究的实践中，张慧丽等[46]利用拉曼光谱技术完成了对拉米夫定水合晶型在加热过程中因失水而导致晶型转变的动态特性研究，选取在(91±1)℃下对拉米夫定水合晶型的加热脱水过程进行研究。对得到的拉曼光谱图进行分析，得到特征峰面积随时间变化的关系，结果表明在加热过程中水合晶型的消失与无水晶型的形成的速率保持一致。TIAN等[47]利用拉曼光谱技术，对水性环境下卡马西平3种晶型和晶Ⅰ、晶Ⅲ型混合物转化为二水合物过程中的转化动力学进行表征。样品在(23±1)℃下分散在水中，并在10～210 min于不同时间点下进行回收。利用拉曼光谱结合定量模型得到的结果表明，水性环境下卡马西平多晶型向二水合物的转化。上述两例均为应用拉曼光谱技术研究药物晶型转变的过程动力学问题提供参考依据。

拉曼光谱技术较多应用于在线过程分析。结晶工艺是药物分离与精制的关键技术[45]，过程分析技术对于药物结晶过程的分析与控制提供了巨大的帮助。利用在线拉曼技术对药物的结晶进行过程控制，也以其自身的优势受到日益广泛的应用。由于水分的红外吸收强，而拉曼吸收弱，因此拉曼光谱适用于检测溶液结晶的过程。HU等[48]利用在线拉曼技术对氟灭酸多晶型的转晶温度进行测定。

4 结束语

值得注意的是，拉曼光谱技术在药物晶型研究中，除了上述优点和适用性，也存在一些固有的缺点。①对于不同的晶型药物品种，拉曼光谱并非全部特征有效，即便不同晶型物质间的拉曼光谱存在差异，这种差异也有可能十分微小。如曹俊姿等[49]在对左炔诺孕酮进行优势药用晶型研究的过程中，发现左炔诺孕酮3种晶型的拉曼光谱图谱基本相似，无法对其进行明显区分；张倩芝[50]在对治疗十二指肠溃疡药物艾普拉唑的两种晶型进行拉曼测试后，发现两者拉曼光谱图差异较小，建议应结合红外光谱对两种晶型进行鉴别。当药物不同晶型的拉曼光谱差异较小时，尝试可以达到更高分辨率的仪器或测试条件是行之有效的方法。②荧光效应的产生是利用拉曼光谱对药物晶型进行研究时一个重要的干扰因素，对于棉酚等容易产生强烈荧光背底的物质，需要合理选择激光波长进行晶型行分析[18]。因此，当采用拉曼光谱对药物晶型进行定性研究，品种的特异性、仪器的分辨率以及测试条件的选择往往是决定拉曼光谱是否能够实现有效检测的重要因素。

虽然拉曼光谱技术仍然具有一定的局限性，但在药物晶型问题的研究上还是表现出巨大的潜力，为药物晶型问题的研究提供更为广阔的思路和角度。特别是随着人们对于拉曼技术认识的加深，多种类型拉曼光谱仪的问世，在线拉曼光谱技术的逐步成熟，相信拉曼光谱技术会在该领域发挥出越来越重要的作用。