金刚藤及菝葜茎、叶的黄酮含量比较研究

况成裕，张清华，郭小藤，崔 燕

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

金刚藤为百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的根茎，又名金刚刺、假萆解[1]，分布于我国陕西、甘肃、湖北、四川、贵州及西藏等地区。其性甘温无毒，有清热解毒、消肿散结之功效。历代本草多用其根茎入药，其茎和叶未见使用。每年8～10月采收后，大量的茎和叶被抛弃。

因金刚藤的主要活性物质是黄酮，黄酮类化合物生物活性众多，经提取分离纯化，可充分应用于医药工业。近年，国内外学者从金刚藤中发现一系列具有生物活性的化学成分[2-3]：落新妇苷、山萘酚、山萘酚-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、黄杞苷、异鼠李素、槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、新异落新妇苷、二氢山萘酚、槲皮素-3-O-葡糖苷等多种黄酮类化合物，具有心血管活性、免疫抑制、减轻肾功能损伤、保肝等作用[4-7]，其中落新妇苷含量较高[8]，且生物活性较强，具有有效降低肾脏损伤、抗炎、免疫抑制、抑制排异反应、保护肝脏等作用[9-10]。本文通过采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC），对金刚藤及菝葜茎、叶中的总黄酮含量及落新妇苷含量进行了对比研究，为菝葜在医药工业方面的开发利用提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

8453型紫外-可见分光光度仪（Agilent公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（Waters公司）；XP205电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ2200DA型数控超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 试药

菝葜于2015年8～9月和2018年9～10月采集于贵州开阳县、修文县和四川安岳县，经鉴定为百合科植物菝葜（Smilax chinaL.），将其根、茎、叶分别洗净、切片、晒干，其根即为金刚藤，茎、叶即为菝葜茎、叶；落新妇苷对照品（自制，含量97.82 %）；乙醇为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取105 ℃干燥至恒重的落新妇苷对照品（含量为97.82 %）约10 mg，精密称定（10.30 mg），置入100 ml量瓶，加乙醇约50 ml，超声使溶解，加乙醇至刻度，摇匀，制成浓度为0.101 mg/ml对照品溶液[11-12]。

2.1.2 供试品溶液的制备 取金刚藤、菝葜茎、菝葜叶细粉各约0.3 g，精密称定，分别置250 ml圆底烧瓶中，精密加入乙醇100 ml，称定重量，水浴回流提取1 h，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液。

2.1.3 检测波长的选择 精密量取对照品溶液与金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液各1 ml，分别置10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀；以乙醇为空白，在200～400 nm波长范围内扫描，对照品溶液与金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液均在292 nm处有最大吸收峰（见图1），因此选择292 nm作为检测波长[13-14]。

图1 紫外扫描图谱

2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀；以乙醇为空白，在292 nm处测定吸光度，以浓度（C，μg/ml）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=41.27C+0.063（r=0.9993）。结果表明，落新妇苷在0～30.6 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密量取对照品溶液、金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液各5 ml，分别置50 ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，连续测定6次吸光度。结果RSD分别为0.413 %（n=6）、0.317 %（n=6）、0.508 %（n=6）、0.643 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密量取对照品溶液、金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液各5 ml，分别置50 ml量瓶，加乙醇至刻度，摇匀，于配置后每隔60 min测定吸光度，共7次，RSD分别为1.97 %（n=7）、2.33 %（n=7）、1.88 %（n=7）、2.57 %（n=7）。结果表明，对照品溶液、供试品溶液在360 min内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取金刚藤、菝葜茎、菝葜叶细粉各约0.3 g，共6份，精密称定，分别置250 ml圆底烧瓶中，精密加入乙醇100 ml，称定重量，水浴回流提取1 h，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 ml，分别置10 ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀；以乙醇为空白，在292 nm波长处测定吸光度，RSD分别为2.77 %（n=6）、3.13 %（n=6）、3.54 %（n=6）。

2.1.8 回收率试验 取落新妇苷对照品（含量为97.82 %）约50 mg，精密称定（52.48 mg），置50 ml量瓶中，加乙醇约30 ml，超声使溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.03 mg/ml溶液。取已知总黄酮含量的金刚藤、菝葜茎、菝葜叶细粉（总黄酮含量分别为51.23，43.22，18.12 mg/g）约0.2 g，各5份，精密称定，分别精密加入落新妇苷对照品溶液（浓度为1.03 mg/ml）5 ml，按2.1.2项方法制备供试品溶液，测定吸光度值并计算回收率。结果见表1。

表1 总黄酮回收率结果

2.1.9 样品含量测定 取不同产地金刚藤及菝葜茎、叶各7批，按2.1.2项方法制备供试品溶液，测定吸光度值并计算总黄酮含量，结果见表2。

表2 总黄酮含量测定结果

2.2 落新妇苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Spherisorb CNRP（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙醇-0.1 %冰乙酸溶液（39:61）；流速：1.0 ml/min；检测波长：291 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的落新妇苷对照品51.72 mg（含量为97.82 %），置50 ml量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得1.01 mg/ml的落新妇苷对照品贮备液；精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，制得0.505 mg/ml的落新妇苷对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取金刚藤、菝葜茎、菝葜叶细粉各约0.5 g，精密称定，分别置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入60 %乙醇30 ml，密塞，称定重量，静置30 min，摇匀，超声提取（40 kW，100 Hz）3 min，放冷，再称定重量，用60 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 分别精密吸取对照品溶液和金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且主峰与杂质峰的分离良好。

图2 HPLC色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密量取落新妇苷对照品贮备液0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 ml，置100 ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，分别制得0，6.06，12.12， 18.18，24.24，30.30 μg/ml的样品溶液，按2.2.1项色谱条件进样检测，测定峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标制备标准曲线，得回归方程及线性范围：Y=87 785X+37 657（r=0.9994），结果表明，落新妇苷进样量在0～0.606 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密量取落新妇苷对照品溶液20 μl，按2.2.1项色谱条件重复测定6次，测得落新妇苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.93 %，表明该方法有良好的系统精密度。

2.2.7 稳定性试验 精密量取落新妇苷对照品溶液，金刚藤、菝葜茎、菝葜叶供试品溶液20 μl，按2.2.1项色谱条件，每隔60 min测定吸光度，各7次。结果表明，供试品溶液在360 min内基本稳定，RSD为2.33 %（n=7）、2.37 %（n=7）、1.87 %（n=7）、2.11 %（n=7）。

2.2.8 重复性试验 取金刚藤、菝葜茎、菝葜叶细粉各约0.5 g，共6份，分别置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入60 %乙醇30 ml，密塞，称定重量，静置30 min，摇匀，超声提取（40 kW，100 Hz）30 min，放冷，再称定重量，用60 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，按2.2.1 项下色谱条件测定吸光度，RSD为3.14 %（n=6）、2.67 %（n=6）、2.44 %（n=6）。

2.2.9 回收率试验 取落新妇苷对照品（含量为97.82 %）50 mg，精密称定（51.51 mg），置50 ml量瓶中，加乙醇约30 ml，超声使溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.01 mg/mL溶液。

取已知落新妇苷含量的金刚藤、菝葜茎、菝葜叶样品（落新妇苷含量分别为4.87，3.97，1.03 mg/g）约0.2 g，各5份，精密称定，分别精密加入落新妇苷对照品溶液（浓度为1.01 mg/ml）2 mL，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，照2.2.1项色谱条件进行测定并计算回收率。结果见表3。

表3 落新妇苷回收率结果

2.2.10 样品含量测定 取不同产地金刚藤及菝葜茎、叶各7批，按2.2.3项方法制备供试品溶液，照2.2.1项色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 样品含量测定结果

3 讨论

近年，关于金刚藤（菝葜根茎）及金刚藤总黄酮提取物的研究越来越多，大部分集中于金刚藤，对菝葜茎、叶的研究很少。菝葜中不同部位黄酮化合物的含量比较也未见报道。本研究比较了金刚藤、菝葜茎、菝葜叶中的总黄酮含量，并证明了落新妇苷是金刚藤中黄酮的指标性成分。结果表明，金刚藤中总黄酮含量为49.87～56.33 mg/g，落新妇苷含量为4.67～5.12 mg/g；菝葜茎中总黄酮含量为40.99～48.56 mg/g，落新妇苷含量为3.67～4.14 mg/g；菝葜叶中总黄酮含量为14.85～22.34 mg/g，落新妇苷含量为0.98～1.32 mg/g。菝葜不同部位的总黄酮含量存在较大差异，菝葜茎、叶可以用于提取分离制备总黄酮，但不可替代金刚藤作为药品使用。