一次性使用血浆病毒灭活输血器材光化学照射后遗传毒性研究

侯 丽，乔春霞，王鸾鸾，孙令骁

（1. 山东省医疗器械产品质量检验中心，山东 济南 250101；2. 山东省医疗器械生物学评价重点实验室，山东济南 250101）

一次性使用血浆病毒灭活输血器材是采用亚甲蓝/光照病毒灭活法，对血浆中人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）等脂质包膜病毒进行灭活，以保证临床输血安全的医疗器械。目前此方法在国内各个血站应用较为广泛[1]。对于血浆病毒灭活输血器材的研究，目前主要集中于对病毒灭活效果、灭活后血浆成分回收率[2-3]、是否产生输血反应[4]等方面，没有对亚甲蓝经光照后输入人体后是否有潜在的毒理学风险进行研究。本文作者模拟血浆病毒灭活输血器材在血站的实际使用过程，并对其遗传毒性进行了研究，以评估此类产品的使用安全性。

1 材料与试剂

1.1 测试样品

一次性使用血浆病毒灭活输血器材（南京双威医学科技公司）。

1.2 试剂

敌克松，环磷酰胺，丝裂霉素，甲基磺酸甲酯，2-氨基芜，三氟胸苷（分析纯，Sigma）；RPMI1640培养基（Hyclone®）；新生牛血清（浙江天杭）；羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液（南京正大天晴，批号1208291）。

1.3 细胞株

CHL细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。

1.4 菌株

鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102 菌株（上海宝录生物科技公司），经组氨酸缺陷型鉴定、脂多糖屏障缺陷鉴定、R因子鉴定、紫外线缺陷型鉴定、四环素抗性鉴定，TA97，TA98，TA100，TA102符合试验要求。

实验前将菌株接种至肉汤培养基中，于恒温振荡器上增菌培养14～16 h（37 ℃，120 r/min）。

1.5 代谢活化系统（S9混合液）

鼠肝微粒体酶混合物（S9匀浆，上海宝录生物科技公司）。使用前添加其他辅助成分[0.4 mol/L MgCl20.2 ml，1.65 mol/L KCl 0.2 ml，0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸1.0 ml，0.025 mol/L NADP 1.6 ml，0.2 mol/L PBS（pH 7.4）6.0 ml]，将S9匀浆1 ml与以上辅助成分混合液混合配制成S9混合液，现用现配。

2 方法

2.1 样品制备方法

按一次性使用血浆病毒灭活输血器材产品使用说明中的操作方法将血浆病毒灭活输血器材的血袋穿刺器刺入羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液中，使其通过亚甲蓝释放件全部充入光照袋至标称容量，并使其混匀，经市售医用病毒灭活柜光照处理，光照处理后经一次性使用血浆病毒灭活输血器材的吸附滤器吸附过滤，制成供试液，受试物含残留的亚甲蓝及其降解产物。供试液制备后，放置-18 ℃保存待用。临用前，将装有供试液的血袋放置37±1 ℃，浸提72±2 h。羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液同法制备作为对照液。

2.2 细菌回复突变试验（Ames试验）

采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA 9 7、TA98、TA100和TA102 4种菌株进行试验。设立样品组，以羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液为阴性对照，敌克松（TA97菌株、TA98菌株、TA100菌株）、2-氨基芴（TA100菌株）、甲基磺酸甲酯（TA102菌株）为阳性对照，采用平板掺入法，各菌株分别在加S9与不加S9混合液的条件下进行试验。在保温的顶层培养基中依次加入每种试验菌株新鲜菌液0.1 ml，样品组分别加供试液0.1 ml（活化组再加10 % S9混合液0.5 ml，无活化组加0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5 ml）；阴性对照组分别加相应的对照液0.1 ml，阳性对照组分别加相应的诱变剂0.1 ml，其余操作相同。每组3管，混匀后迅速将每管溶液分别倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，倒置于37 ℃培养箱中培养48～72 h观察结果。计数并记录每一平皿的回变菌落数，并计算出3个平皿的平均值。将所用的4个测定品系的每一品系被测平板的回复突变平均数与其相应的阴性对照回复突变平均数作比较。

2.3 体外小鼠淋巴瘤细胞突变试验

采用L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）细胞进行试验。设立样品组，以羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液为阴性对照，甲磺酸甲酯（MMS，无活化系统，10 µg/ml）、7, 12-二甲基苯蒽（DMBA，活化系统，2.5 µg/ml）作为阳性对照。在加S9与不加S9混合液的条件下进行试验，首先调整L5178Y TK+/- 细胞浓度至2×105个细胞/ml，取10 ml细胞悬液与9 ml供试液或对照溶液混合后接触培养，最后加入TFT（三氟胸苷，终浓度为3 µg/ml）培养。计数各平板无集落生长的孔数并计算PE0（第0天平板效率）和PE2（第2天平板效率）、RS（平板效率相对存活率）、MF（TFT抗性突变频率）。

2.4 体外染色体畸变试验

采用中国仓鼠肺细胞（CHL）进行试验。设立样品组，以羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液为阴性对照，丝裂霉素C（MMC，无活化系统，短期接触0.4 µg/ml和持续接触0.2 µg/ml）、环磷酰胺（CP，活化系统，40 mg/ml）作为阳性对照。取对数生长期的CHL细胞，在加S9与不加S9混合液的条件下进行，短期接触组细胞与供试液或对照液接触6 h，随后更换新鲜培养液培养24 h，持续接触组细胞与供试液或对照液接触24 h，收获细胞前3 h用秋水仙素处理细胞，随后胰酶处理成细胞悬液，进行低渗处理后固定，用1～2滴细胞悬液滴片，自然干燥后用5 %吉姆萨染液染色，镜下观察并记分，进行染色体畸变分析。试验组和对照组各分析200个分散良好的中期分裂相，阳性组记录100个分散良好的中期分裂相。

3 结果

3.1 Ames试验结果

平板计数，所有平皿背景生长良好，菌株自发回变菌落数在本实验室鉴定范围内（见表1）；阳性对照组回变菌落平均值为介质对照组回变菌落平均值的3倍以上；试验组回变菌落平均值与对照组回变菌落平均值相比无明显差异。故试验组与对照组相比，该供试液对受试菌株TA97、TA98、TA100和TA102呈阴性反应（见表2）。

表1 回变菌落数鉴定范围

表 2 Ames试验结果（±s）

表 2 Ames试验结果（±s）

组别 TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9试验组 108±6.6 139±14.0 29±2.6 31±3.1 193±4.0 111±2.6 226±8.0 258±9.5阴性对照 107±10.1 130±13.4 28±2.3 28±2.5 99±11.2 105±7.0 272±10.6 221±15.1阳性对照 731±85.5 924±129.9 1177±107.2 2068±154.4 2349±258.0 2697±294.9 2286±120.0 2235±228.6

表3 体外小鼠淋巴瘤细胞突变试验结果

3.2 体外小鼠淋巴瘤细胞突变试验结果

介质对照组的PE0在60 %～140 %范围内，PE2在70 %～130 %之间，试验组与对照组比较，该供试液L5178Y TK+/- clone9（3.7.2C）细胞的突变频率在S9代谢活化剂存在或不存在的情况下均低于介质对照组的两倍，试验结果表明该试验反应是阴性的（见表3）。

3.3 体外染色体畸变试验结果

在加和不加S9代谢活化系统的情况下，染色体畸变率与介质对照相比差异均无统计学意义（P＞0.05），表明该供试液无致染色体畸变性（见表4）。

表4 染色体结构畸变试验结果

4 讨论

亚甲蓝是一种碱性生物染料，也是国家药典收录的静脉注射药物，临床主要用于治疗亚硝酸盐中毒或诊断示踪剂。在治疗氰化物中毒时24 h总量不超过500 mg，静脉注射剂量过大（＞500 mg）时可出现不良反应。血浆病毒灭活的亚甲蓝用量为0.9～1.3 µmol/L，且在病毒灭活后还会用专门的一次性滤器滤除血浆中85 %以上的亚甲蓝[5]，因此患者所接受的剂量远在安全用量范围以下。但亚甲蓝经光照后的残留及其降解产物输入人体是否产生未知的不良反应，如遗传毒性、长期毒性等未见报道。本研究选择羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液为模拟液，并通过光照、过滤及储存等临床处理过程，评估光照后亚甲蓝的残留及其降解产物产生的遗传毒性作用。

GB/T16886.12规定样品制备时除推荐方法外，也可使用其他适合于器械的性质和应用或适合于危害识别方法的浸提介质[6]，故本研究没有按GB/T16886.12中常规的样品制备方法，而是按产品使用说明书的使用方法进行样品制备。羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液在临床上主要应用于大出血、大面积烧伤、重症监护或手术病人，具有快速、强效的扩容效应，用以扩充血容量，改善微循环，是临床上广泛使用的血浆代用品[7]。在本遗传毒性试验系统中，羟乙基淀粉130/0.4 氯化钠注射液作为对照组并未引起试验体系发生变化。

本研究根据GB/T16886.3中遗传毒性试验方案1进行试验[8]。Ames试验从基因水平上反映了遗传物质受损伤情况。本研究结果显示，在无论有无活化系统（S9混合液）存在情况下，TA97、TA98、TA100和TA102菌株回复突变菌落数均接近自发突变，与阴性对照组相比差异无统计学意义。结果提示亚甲蓝经光照后的残留及其降解产物在体外Ames试验中未发现致突变作用。小鼠淋巴瘤试验以突变频率作为指标，通过试验样品诱导小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）tk基因受损伤而发生突变的请况，评价受试样品潜在的致突变性。在本研究试验条件下，亚甲蓝经光照后的残留及其降解产物没有引起小鼠淋巴瘤细胞克隆形成率的显著升高。染色体畸变试验以染色体畸变率作为指标，通过诱导细胞染色体发生畸变性评价材料潜在的致突变性。在本研究试验条件下，亚甲蓝经光照后的残留及其降解产物没有引起细胞染色体畸变率的显著升高。以上结果显示，亚甲蓝经光照后的残留及其降解产物在本次试验条件下没有潜在的遗传毒性。