HPLC同时测定蒙药阿那日-4中3种成分的含量

闫 烁，薄彧坤，李景琦，张慧彬，王丽娟，张慧文,2*

（1. 包头医学院，内蒙古 包头 014040；2. 内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110）

阿那日-4，又名四味石榴散或申布如西巴，在《四部医典·后续部》、《金匮方释》、《蒙医成方选》和《高世格梅林方》等蒙医著作中均有记载[1]，由君药全石榴、臣药肉桂、佐药白豆蔻和使药荜茇组成，用于祛“巴达干协日”，对胃溃疡、消化不良等均有较好疗效[2-3]。有研究证实阿那日-4可提高胃浆中的NO含量，对小鼠乙醇及应激反应引起的胃溃疡有一定治疗作用，并对幽门结扎性胃溃疡大鼠具有胃黏膜保护作用[4-5]。在临床上，以阿那日-4为基础形成了阿那日系列复方，如阿那日-5[6]、阿那日-8[7]和阿那日-14[8]等，目前在市场有售，有深入研究价值[9]。通过查阅文献资料仅见报道阿那日-5、阿那日-8和阿那日-14中的胡椒碱和微量元素含量测定[10-12]，阿那日-4的活性成分和质量控制方法研究尚属空白，亟待完善。阿那日-4中全石榴的活性成分是鞣花酸，有良好的抗氧化和抗肿瘤活性[13-14]；肉桂中的桂皮醛有抗溃疡、抗肿瘤和加强胃肠道运动功能[15-16]；荜茇的活性成分是胡椒碱，有抗胃溃疡和免疫调节作用[17-18]。本实验建立了高效液相色谱法（HPLC）同时检测蒙药阿那日-4中鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱含量的方法，为制定阿那日-4质量控制方法提供参考。

1 仪器与试药

Shimadzu高效液相色谱仪（日本岛津，包括紫外可见光检测器）；LabSolutions色谱工作站；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 µm）；Sartorius BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯）；AS-10200型超声清洗器（天津奥特赛恩斯）；SHZ-3型循环水真空泵（上海亚荣）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣）。

阿那日-4及阴性样品均由内蒙古科技大学包头医学院药学院药剂教研室提供。对照品鞣花酸（批号：C10024692，上海麦克林）、桂皮醛（批号：J1619008，上海阿拉丁）、胡椒碱（批号：MUST-13080202，成都曼斯特）。甲醇、乙腈（HPLC级，美国Fisher），纯净水（娃哈哈），其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱对照品，分别加甲醇制成含鞣花酸5.0 mg/ml、桂皮醛3.0 mg/ml、胡椒碱3.0 mg/ml对照品储备液。分别精密量取上述3种储备液各0.5 ml，置入5 ml量瓶，用甲醇定容，摇匀，得含鞣花酸0.50 mg/ml、桂皮醛0.30 mg/ml、胡椒碱0.30 mg/ml混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密称取阿那日-4约1 g，置入50 ml圆底烧瓶，加10 ml甲醇，超声（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放至室温，转移至10 ml量瓶，用甲醇定容，摇匀后用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性供试溶液 按阿那日-4处方，分别制备缺石榴，缺肉桂，缺荜茇的阴性样品粉末1 g，按“2.1.2”项下方法，超声提取30 min，上清用0.22 µm微孔滤膜过滤作为阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 µm）色谱柱；流动相：甲醇（A）-0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～ 40 min，5 % A～100 % A）；流速1.0 ml/min；检测波长为271 nm；柱温30 ℃；进样量20 μl。在上述色谱条件下，鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱的分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000。

2.3 专属性试验

分别取混合对照品溶液、样品溶液、各阴性供试溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定。供试品溶液的色谱峰与混合对照品溶液相应成分峰的保留时间一致，阴性供试溶液无相应色谱峰。结果表明，样品中其他成分对鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱3种活性成分测定无干扰，方法专属性良好。

图1 专属性试验色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密量取各对照品储备液适量置入5 ml量瓶，加甲醇，定容，得混合对照品溶液，然后逐级稀释得一系列混合对照品工作溶液，分别按“2.2”项下色谱条件测定。以峰面积-对照品质量浓度进行线性回归，各对照品的线性方程、线性范围和相关系数见表1。

表1 3种成分的线性方程、相关系数、线性范围

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续测定5次，记录各对照品的峰面积，其RSD（n=5）分别为0.49 %，0.63 %，0.41 %，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批次阿那日-4（批号为20170501），按“2.1.2”项下方法平行制备5份样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，并分别计算含量；结果鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱含量的平均值（n=5）分别为3.15，2.53，1.77 mg/g，RSD分别为2.86 %，2.17 %，1.22 %，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取阿那日-4按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，室温放置，按“2.2”项下色谱条件分别于0，4，8，12，24 h 进样，鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱峰面积的RSD（n=5）分别为2.09 %，1.47 %，1.55%，表明样品溶液在24 h 内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知各成分含量的同一批次阿那日-4（批号为20170501）6份，每份0.5 g，精密称定后每份分别加入5.0 mg/ml鞣花酸0.315 ml，3.0 mg/ml桂皮醛0.422 ml，3.0 mg/ml胡椒碱0.295 ml（各对照品与已知样品中成分量比为1:1），甲醇补足至10 ml，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下方法测定，用外标法计算各相应成分的含量，计算回收率及RSD。结果表明，鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱回收率在98.55 % ～ 101.68 %，RSD均＜3 %，符合含量测定的准确性要求。

表2 加样回收率试验的结果（n=6）

2.9 样品测定

取5批次阿那日-4，分别按“2.1.2”项下方法制备样品溶液，样品中3种待测成分的含量见表3。

表3 5批次样品的3个成分含量测定（n=5）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱3种成分的紫外吸收光谱存在差异，最大吸收波长分别是254，290 和343 nm，通过实验比较，鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱均在271 nm 波长处有较大吸收，且灵敏度高，故将检测波长定为271 nm。

3.2 流动相的选择

实验中对甲醇-水、甲醇-水（含0.1 %磷酸）、甲醇-水（含0.1 %甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1 %磷酸）和乙腈-水（含0.1 %甲酸）流动相系统进行了考察，结果显示以甲醇-水（含0.1 %磷酸）为流动相时，供试品中鞣花酸、桂皮醛和胡椒碱分离效果较好。

3.3 供试品处理方法的选择

实验中分别以纯水、20 % 甲醇、40 % 甲醇、60 %甲醇、80 %甲醇水溶液和甲醇为溶剂，并分别采取超声20，30，40 min和回流提取30，60，90 min处理供试品，结果以甲醇为溶剂超声30 min，3种成分含量最高。