分子生物色谱技术中生物大分子在中药研究中的应用进展

刘珏玲,安琪,陈素娥,赵龙山,刘亮亮

(1.山西卫生健康职业学院山西生物样品分析检测中心,山西 晋中 030619;2.山西省中医学校,山西 晋中 030619;3.沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110013)

中药的活性物质和作用机理的研究，是中药发展的瓶颈问题。中药及复方具有多组分、多靶点的特点[1]，从而具有复杂性、多效性和某些成分的双向调节性。如果单纯依靠传统分离分析技术研究中药及复方中的药效物质，过程复杂且难度较大，限制了中医药的发展进程[2]。分子生物色谱(molecular biochromatography,MBC)是一种以生物大分子为固定相配基的新型液相色谱技术，其原理是分子特异性识别，具有重现性好、分析速度快、具有药理学意义等特点。由于不同药物组分与生物大分子结合度及亲和性不同，使得其在色谱柱上的保留时间不同，由此可将活性物质快速筛选出来。同时MBC与其他分析检测技术结合，能进一步阐明与机体有关的药效组分，将其应用于中药复方活性成分的筛选，可有效地排除无生物活性成分的干扰，为中药药效物质基础研究提供新的解决途径[3-6]。本文对近10年国内外分子生物色谱技术在中药物质基础分析方面的应用和研究进展进行了归纳总结,旨在为药学工作者更好地掌握和应用分子生物色谱技术提供参考。

1 MBC常用大分子

1.1 血浆蛋白 血浆蛋白能与药物发生可逆结合成为“血浆蛋白-药物复合物”，到达作用部位发生药理作用。将血浆蛋白固载于载体上作为生物色谱填料，形成一种可以模拟体内环境中药物与血浆蛋白间相互作用的色谱系统，由于不同的药物分子与血浆蛋白的结合率具有差异，它在固定相的保留行为也不同，结合色谱技术中的各种参数计算，一方面可以筛选中药中的活性物质，还能进行药物与血浆蛋白的作用关系的研究[7-8]。

1.1.1 人血白蛋白(human serum albumin，HSA) HSA是人类血液中最丰富的血浆蛋白质，其分子量为66.5 kDa，血清中浓度约为35～50 g·L-1。HSA能与带负电荷的化合物如激素、脂肪酸等结合并运输[9]。孔亮等[10]把HSA固定在硅胶上作为HPLC中的固定相，选择50 mmol·mL-1含乙腈的磷酸钾缓冲液为流动相，分离了当归、赤芍、黄芪、川芎的水提液，建立了4种中药的生物色谱图库，之后优化当归水提液的MBC条件，进一步研究当归水提液中阿魏酸与藁本内酯的含量，分别是0.028%和0.01%，从而对当归指标成分进行质量控制。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)与HSA结构具有相似性且价格低廉，因此可以替代HSA制备BSA色谱柱用于中药活性物质筛选[11]。潘再法等[12]利用静电吸附原理制备出BSA整体柱应用于当归甲醇液的成分分析，将所得的2个馏分进行气相色谱-质谱分析，鉴定出其含量最多的成分为藁本内酯。

1.1.2 酸性糖蛋白(α1- acid glycoprotein，AGP) AGP是由183个氨基酸组成的多肽链，平均分子量为41 kDa，浓度在0.5～1.0 mg·mL-1之间，且随着病理变化而改变[13]。AGP是许多中性药物如普萘洛尔、阿咪普拉明、利多卡因和维拉帕米等的转运蛋白[14]。Anguizola等[15]建立了一种包封α1-AGP为固定相用以研究药物与α1-AGP的相互作用的方法。通过在肼活化的多孔二氧化硅中对AGP进行物理包封并用氧化糖原作为封盖剂。并对该条件进行检验和优化。在pH 7.4和37 ℃动态条件下测定卡马西平在AGP-硅胶固定相上吸附等温线，从而得出结合平衡常数及结合的位点数，结果AGP的结合平衡常数为(1.0±0.5)×105mol·L-1，与之前报道的值一致。相同的方法可以延伸到其他药物-蛋白质相互作用的研究，包括在高通量筛选药物及相互作用关系的快速分析方面具有潜在应用的价值。

1.2 受体类 受体是一类功能蛋白，是药物发挥作用的主要靶点，通过受体特异性地识别、结合，通过信息传导从而参与生理调控、神经传导等多种机体生理病理过程[16]。若将受体固载于固定相表面，把其特异性结合作用与色谱分离技术结合，就能建立一种快速筛选药效物质的方法[17]，在此色谱柱中可保留能与受体特异性结合的中药活性组分，而无保留行为的物质流出，活性筛选和色谱分离两种模式可同时进行。基于高亲和力固定化受体的色谱法有望成为确认药物靶标和药物受体相互作用分析的替代方法。

1.2.1 α1-肾上腺素受体 α1-肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor，α1-AR)参与机体的许多重要的生理活动，由于α1-AR主要是影响心血管系统，因此可以用来筛选对心血管系统有效应的活性物质[18]。王雪艳[19]建立了一种α1A-肾上腺素配体的分子生物色谱法，并用其对红花进行研究，确定了羟基红花黄色素A是红花中与 α1A-AR有特异性结合的活性成分，该结果表明羟基红花黄色素A可能对心血管系统有作用，有后期继续研究的价值，这为中药药效成分筛选提供新思路。

1.2.2 β2-肾上腺素受体(β2-adrenergic receptor，β2-AR) β2-AR为G蛋白偶联受体超家族的一员，是治疗呼吸系统疾病的重要靶点[20]。为了筛选红景天中具有多重作用靶点的生物活性成分，Liu等[21]将纯化的β2-AR和电压依赖性阴离子通道亚型1(voltage dependent anion channel isoform 1，VDAC-1)受体同时固定在氨基酸微球表面，红景天水提物过柱分离后，保留成分经 HPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定是大花红天素和红景天苷。多索茶碱是一种黄嘌呤衍生物，在临床上被认为是治疗哮喘的主要药物，Zhang等[22]采用高效亲和层析法研究β2-AR和多索茶碱之间的相互作用研究。固定在硅胶的β2-AR运用在前沿分析、非线性层析等色谱方法，并通过探索位点研究其结合机理。非线性色谱结果中多索茶碱与固定化β2-AR结合的结合常数为7.70×104mol·L-1，表明β2-AR是多索茶碱作用的靶点，前沿色谱中结合常数的结果为5.91×104mol·L-1，证明多索茶碱和β2-AR只有一种类型的结合位点，分子对接结果显示，多索茶碱与β2-AR结合是氢键作用介导，β2-AR第5个跨膜域的Ser169和Ser173是受体-药物相互作用过程中氢键形成的结合位点。该实验也证实了固定化β2-AR在筛选未知药物或扩大药物新作用方向的可行性。

1.2.3 过氧化物酶体增殖物激活受体 过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs) 属于配体依赖性转录因子核受体,有α、δ及γ 3种异构形式[23]。其中PPARγ是研究较多的受体，是调控内分泌代谢的重要因子[24]。在多种细胞中均有表达，可参与糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化等体内众多疾病的调节，是治疗众多疾病的潜在靶点[25]。Zhou等[26]建立PPARγ/DNA折纸生物色谱法，用于从复杂成分中筛选PPARγ拮抗剂。将人参总皂苷进入PPARγ/DNA柱，其中R0为无保留行为组分，而R1组分在该柱上被保留，这两种组分分别经过 HPLC 和 HPLC/MS分析。结果表明，人参皂苷 Re是从总皂苷中分离可与PPARγ结合的活性分子。利用PPARγ/DNA折纸生物色谱模型特定的识别结合复杂体系的化合物可以有效地筛选目标成分，并通过高效液相色谱/质谱系统准确鉴定。这将有助于中药及复方中物质基础的快速筛选。

1.3 酶 在药物筛选中，酶是最大的目标系统，许多酶模型在药物研发过程中发挥重要作用，实际上许多市售药物的药理活性均属于酶抑制剂，目前许多新药开发仍然以酶抑制剂为研究对象[27]。酶通过吸附、共价键结合、交联、包埋等方法固定于载体上，以此寻找某些酶的抑制剂或激动剂，为多种疾病如肿瘤、糖尿病、肝炎等提供治疗依据。因此以酶为固定相填料的MBC将在药效成分筛选中发挥更大的作用[28]。Luo等[29]使用模拟C型肝炎病毒的蛋白酶固载在固定相上，结合质谱快速筛选复杂体系中的C型肝炎病毒的蛋白酶抑制剂，实验发现叶下珠属草本类植物提取物中酚酸类物质在C型肝炎病毒的蛋白酶柱上具有保留行为，通过质谱鉴定证实其中的云实素具有活性，从而建立起一种从天然产物中高通量筛选高效低毒的治疗C型肝炎病毒的活性成分的新方法。

1.4 DNA DNA是很多药物的作用靶点如抗菌、抗肿瘤、抗病毒等，药物小分子可与DNA通过嵌插作用、沟槽结合、静电结合、长距组装等相结合，由于沟槽结合和嵌插不会影响 DNA 的结构而影响其活性，因此DNA通过上述方式构建MBC ，以此筛选天然产物中的活性物质[30-31]。Su等[32]以小牛胸腺 DNA为固定相，作为一维色谱分离黄连、黄柏和苦参中的活性成分，而为二维色谱ODS 柱色谱-质谱系统，对一维色谱的粗产物进行分离分析鉴定，实现了中药复杂样品的高效分离和活性成分筛选鉴定一体化流程。

1.5 核心组蛋白 核心组蛋白存在于真核细胞核小体中间N-末端，会以多种方式穿过而暴露于核心颗粒外，暴露的组蛋白 N-端尾部可进行多种共价修饰从而影响基因转录的激活、沉默、DNA 损伤修复等重要生物学过程[33]。对组蛋白修饰的下游生物学反应的研究表明，组蛋白相互作用蛋白是一种潜在的基因转录水平的抗癌药物开发靶蛋白。蔡汉宁等[34]建立以核心组蛋白 MBC，进行复杂组分的分析，使之成为表征与靶分子组蛋白相互作用蛋白的探针，筛选出9 种组蛋白作用蛋白。

2 中药研究中的应用

2.1 分离鉴定中药的活性成分 分子生物色谱作为一种体外活性筛选技术，在中药药效物质分离研究中被广泛应用。王芳焕等[35]将羰基咪唑活化的氨丙基硅胶与HSA进行结合，以此作为生物色谱填料，并用元素分析的方法考察键合效率，根据氮元素和碳元素质量分数的变化量计算出HSA占填料质量的8.16%，判断出HSA 已被键合到硅胶表面。将铁棒锤总生物碱提取液过柱分离，获得的HSA柱的保留组分，所得组分经反相液相色谱-离子阱多级质谱联用分析，从中鉴定4种活性物质，获得了较好的分离结果。Wang等[36]建立了重组β2-AR亲和层析色谱联合飞行时间质谱在线检测的方法，用于从天然植物提取物、中药等复杂体系中寻找β2-AR配体。实验中流动相选择2.5 mmol·L-1Tris - HCl,0.5 mol·L-1MgCl2和0.25 mol·L-1乙二胺四乙酸，从活血胶囊水提物中鉴定出阿魏酸、羟色胺黄A和柚皮苷是与β2-AR特异性结合的具有生物活性的化合物。该方法可以同时识别、分离和鉴定多种生物活性物质，可以用于中药及天然药物中生物活性化合物的高通量筛选。

2.2 中药与受体/血浆蛋白的相互作用关系 研究功能蛋白大分子与药物分子相互作用对于药物开发及应用来说，至关重要。其相互作用的研究将有助于阐明生物体内药物的作用过程和新药开发[37]。受体生物色谱不仅能判定药物在体内的作用靶点，还可以研究药物与受体的作用强度以及与其他药物的竞争作用。蔡晓明等[38]将HSA蛋白键合硅胶表面作为固定相并填成色谱柱，测定药物与蛋白的结合率，其原理是计算药物在该色谱柱上与空白硅胶柱上的保留时间差得到。以华法令为模型化合物对比HSA MBC与传统超滤法测得的结合率，结果在统计学上没有差异，在此基础上测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA的相对结合率，结果分别为10.26%和10.20%。芍药甘草汤被广泛用于治疗肌肉痉挛和哮喘，但其中的药效物质及机制并不清楚，Li等[39]使用固定化β2-AR色谱分离结合飞行时间质谱联用技术鉴定芍药甘草汤水提物。发现芍药苷和甘草苷是其中具有生物活性的化合物。结合β2-AR前沿色谱的分析，芍药苷和甘草苷与β2-AR只有一个结合位点,且计算出结合常数分别为 (2.16±0.10)×104、(2.95±0.15)×104mol·L-1。

2.3 质量控制 将分子生物色谱应用于中药质量控制的方法学研究，根据色谱活性成分的筛选结果，建立有效的指纹分析质量控制方法。对于一些有效成分尚不清楚的中药，可以利用其指纹分析法进行快速的质量监控[3]。Wang等[40]将硅胶键合HSA柱和反相 HPLC 柱联合使用，作为二维生物色谱应用于分析中药复方龙胆泻肝汤中生物活性成分的指纹图谱，发现有100多种活性成分可以与HSA柱结合，根据保留时间，结合其他检测方法所提供的信息，鉴定出19种成分。

3 结语

MBC作为一种体外活性筛选技术，具有重现性好、分析速度快、具有药理学意义等特点，在中药研究方面有很大的发展空间和良好的发展前景。对于中药材及复方制剂而言，选择不同生物大分子作为固定相配基，MBC在中药活性成分筛选、作用关系研究、靶标确认等方面可发挥重要作用。但同时也存在模拟体内环境不完全、制备固定相困难、使用色谱柱寿命短和处理量小等亟待解决的问题[41]。相信通过多学科交叉、新技术、新材料的应用等手段将极大地扩大MBC的使用范围，为中医药的发展做出更大的贡献。