玉米肽螯合硒元素的制备工艺及其保肝作用研究

2019-02-23刘晓美李圆圆王升光马青琳姜珊高鹏

山东科学 2019年1期

刘晓美，李圆圆，王升光，马青琳，姜珊，高鹏

(山东中医药大学，山东济南 250355)

蛋白质是玉米蛋白粉中含量最高的成分，约占60%～70%，除此之外还含有大量的淀粉和纤维素[1]，以及丰富的微量元素。由于玉米蛋白缺少赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)等人体必需氨基酸[2]，有特殊的味道和色泽，水溶性差，目前国内主要将其用于动物饲料中或者直接处理排放，极大地浪费了资源[3]。营养学研究表明，蛋白质需要通过酶解转变成分子量更小的肽后才能被吸收。玉米肽含有13.18%的丙氨酸和17.15%亮氨酸，能够减慢人体吸收乙醇的速度并加快其在体内的代谢，从而起到解除乙醇毒性、保护肝脏的作用[4]。硒元素有“护肝卫士”之称，能够抗氧化、抗自由基。具有生物活性的多肽通过共价化学键与金属离子发生螯合，能够显著提高金属元素在机体内的吸收利用率[5-7]。王真真等[8]的研究表明，玉米肽螯合硒元素能够增强醒酒保肝的作用。目前国内对于玉米肽-硒的研究，主要侧重于富硒玉米蛋白酶解得到的富硒玉米肽[9]。曾庆瑞等[10]研究表明，功能活性肽螯合微量元素，既可减少微量元素的成本，又能使蛋白质和微量元素的生物利用率都得到显著提高。因此，本实验主要研究玉米蛋白经过酶解成玉米肽后与硒元素的螯合。

本文通过考察玉米肽的酶解工艺，使玉米蛋白充分酶解获得具有更高活性的玉米肽，并采用玉米肽与硒元素螯合工艺，获得最优工艺参数。通过四氯化碳肝损伤的小鼠模型，确证其对肝脏的保护作用，为玉米肽的开发和利用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 试剂

谷丙转氨酶(ALT)(分析纯，南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基转移酶(AST)(分析纯，南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(CCl4)(分析纯，上海国药集团)；水飞蓟素(Silymarin)(分析纯，德国马博士大药厂)。

玉米蛋白(购于陕西森弗天然制品有限公司)；胰蛋白酶(酶活≥ 100 000 U/g，上海源叶生物科技有限公司)；菠萝蛋白酶(酶活≥100 000 U/g ，上海源叶生物科技有限公司)。

1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计(UV1100，上海天美科学仪器有限公司)；酶标仪(68SM800，上海永创医疗器械有限公司)；实验室pH计(FE-20，梅特勒仪器有限公司)；低温高速离心机( 3K15 ，SIGMA 公司)。

1.3 实验动物

昆明种小鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2017-0011)，100只雄性，体重(20±2 ) g，6～7周龄。

2 实验方法

2.1 玉米蛋白酶解工艺流程

本实验先用蛋白酶水解蛋白原料，使其酶解为片段后再加入胰蛋白酶模拟小肠的水解环境，最终得到小分子的活性肽。实验过程见图1。

图1 玉米蛋白酶解过程
Fig.1 Corn proteolysis process

2.2 玉米肽酶解工艺考察

2.2.1 玉米蛋白酶解工艺单因素试验

以蛋白质的水解度为考察指标，底物质量分数为10%时，分别考察加酶的质量分数(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解 pH(5、6、7、8、9)以及酶解温度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)对玉米蛋白水解度的影响，进行单因素试验。

2.2.2 蛋白质水解度的测定

蛋白质水解度的测定采用茚三酮法[11]。蛋白质水解过程中被裂解的肽键数h(mmoL/g)与蛋白质的总肽键数htot(mmoL/g)之比称为水解度(DH)。

DH=h/htot×100%。

2.2.3 菠萝蛋白酶、胰蛋白酶酶解的正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取酶解时间(A)、酶解温度(B)、酶质量分数(C)和酶解pH(D)4个因素，按L9(34)正交设计[12]优选酶解工艺，各因素及水平设计如表1所示，每组重复3次。

表1 菠萝蛋白酶、胰蛋白酶酶解 L9(34)正交试验因素水平表

2.3 响应面法优化玉米螯合硒元素的条件

2.3.1 玉米螯合硒元素的工艺流程

本实验通过响应面法优化玉米肽螯合硒元素的制备工艺，实验过程见图2。

图2 玉米肽螯合工艺流程
Fig.2 Chelating process of corn peptide

2.3.2 玉米肽螯合硒元素螯合率的测定方法

采用 3,3′-二氨基联苯胺比色法[13]，对螯合物中硒含量进行测定。

螯合率=M1/M0×100%，

其中，M1为螯合物中硒的含量，μg；M0为加入反应体系中硒的总量，μg。

2.3.3 玉米肽-硒螯合工艺单因素试验

2.3.4 螯合工艺响应面法优化试验法

2.3.4.1 玉米肽-硒螯合工艺响应面优化试验

以玉米肽-硒螯合单因素试验结果为基础，选取螯合时间(X1)、螯合温度(X2)、玉米肽-硒摩尔比(X3)以及螯合pH(X4)4个因素，根据Box-Behnken响应面试验设计原理，对螯合反应的硒含量指标进行响应面优化试验设计，见表2。

表2 玉米肽-硒螯合工艺响应面试验水平与编码表

2.4 保肝作用研究

2.4.1 小鼠四氯化碳急性肝损伤模型的建立

小鼠四氯化碳急性肝损伤模型的建立参考文献[14]。将50只昆明雄性小鼠，按照正常对照组、四氯化碳模型组、玉米肽组、玉米肽螯合硒元素组、阳性对照水飞蓟素组随机分为5组，每组10只。各组小鼠以标准饲料喂养，自由饮水，使其在室温下适应一周。一周后，正常对照组和四氯化碳模型组每日按10 mL/kg灌胃生理盐水1次，玉米肽组和玉米肽-硒敖合物组每日按200 mg/kg剂量灌胃。阳性对照组按每日50 mg/kg剂量定时灌胃水飞蓟素1次。连续灌胃15 d，末次给药5 h，正常对照组腹腔注射橄榄油10 mL/kg，其余组别腹腔注射体积分数为0.125%的四氯化碳橄榄油溶液10 mL/kg。禁食不禁水12 h后，眼球取血，处死小鼠，剖腹取出肝脏，生理盐水洗后，取肝制肝匀浆备用。在整个饲养周期内，每2 d称量一次体重，记录小鼠的体重变化。

2.4.2 检测指标

按试剂盒说明书方法测定血清中 ALT、AST 活力以及肝脏指数。

肝脏指数(mg/g)= 肝脏质量(mg)/体重(g)。

2.4.3 数据统计与分析

实验数据用 SPSS19.0 统计软件包中的单因素方差分析，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。结果以平均值±标准差表示。

3 实验结果与分析

3.1 菠萝蛋白酶酶解正交试验

菠萝蛋白酶酶解正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 菠萝蛋白酶酶解玉米蛋白工艺正交试验极差分析结果

表4 菠萝蛋白酶酶解正交试验方差分析结果

注：P<0.05 具有统计学意义

由表3得出酶解影响因素由大到小顺序为：酶质量分数、酶解温度、酶解pH、酶解时间；由均值K得出最佳因素组合为A2B2C2D1，即菠萝蛋白酶酶解玉米蛋白的最佳的酶解工艺为：在酶解温度 50 ℃，菠萝蛋白酶质量分数3.0%，酶解pH 7.0 条件下酶解3 h。由表4得出影响因素与表3结果一致，且由p值可知，酶质量分数与酶解时间对水解度的影响具有显著性差异。

3.2 胰蛋白酶酶解正交试验

胰蛋白酶酶解正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 胰蛋白酶酶解玉米蛋白工艺正交试验极差分析结果

表6 胰蛋白酶酶解正交试验方差分析结果

注：P<0.05 具有统计学意义

由表5可以得出酶解影响因素由大到小顺序为：酶质量分数、酶解温度、酶解 pH、酶解时间；由均值K得出最佳因素组合为A3B1C2D2，即胰蛋白酶的最佳酶解工艺为：以胰蛋白酶质量分数为2.0%，酶解温度为40 ℃、酶解pH 8.0条件下酶解 3 h。

由表6中F值可知，影响因素与表5结果一致，且由P值可知，酶质量分数与酶解时间对水解度的影响具有显著性差异。

3.3 玉米肽酶解最佳工艺

取玉米蛋白适量，加入纯水使底物质量分数为10%，用质量分数为10%的氢氧化钠调节pH为7.0，加入质量分数为3.0%的菠萝蛋白酶时，在 50 ℃酶解3 h；待完成后用质量分数为10%的氢氧化钠调节pH为8.0，加入质量分数为2%的胰蛋白酶在40 ℃、转速 45～50 r/min 酶解3 h，煮沸，高温杀酶 15 min,迅速冷却至室温。测定玉米肽的水解度为38.15%。