清肾颗粒对肾纤维化大鼠P-selectin/PSGL-1的干预作用

陈友雪 ，王亿平，金 华，王 东，张 磊

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院肾病科，安徽 合肥 230031)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是一个重要的世界性健康问题，其病理基础是肾纤维化。前期研究表明，CKD患者P-选择素(P-selectin)水平表达异常，提示P-selectin与肾脏纤维化过程密切相关[1]。P-selectin的表达可能成为肾脏病变的标志，其与P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)的结合是启动炎性反应和维持炎性状态的一个关键因素[2-3]。本实验拟观察清肾颗粒是否能够通过抑制P-selectin和PSGL-1的表达，从而达到抗5/6肾切除大鼠肾纤维化的作用。

1 材料

1.1 动物 选取72只雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，全部购自上海杰思捷实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006]。

1.2 药物与试剂 清肾颗粒由生大黄、白花蛇舌草、丹参、泽泻等药物组成。药材由安徽中医药大学第一附属医院药房统一进货，每袋颗粒剂10 g，皖药制字BZ20080011。氯沙坦钾由默沙东公司生产，每粒50 mg，国药准字H20130409。CD62P/P-Selectin抗体、CD162/PSGL-1抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为AG09117573、AD110342。

2 方法

2.1 模型复制与分组 除正常组12只之外，其余60只大鼠均按文献[4]方法复制5/6肾切除肾纤维化模型。将大鼠禁食12 h，麻醉，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上、下极各1/3，用明胶海绵压迫止血1 min，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，2次共切除5/6肾脏。采用SPSS 17. 0 产生的随机号随机分为模型组，清肾颗粒高、中、低剂量组，氯沙坦组，每组12只。

2.2 给药方法 各组动物均在模型复制后第1天开始灌胃，每日1次，每次2 mL。正常组、模型组分别采用等容量温水灌胃；清肾颗粒低、中、高剂量组分别按每日4.0、8.0、16.0 g/kg(4.0 g/kg为成人临床等效剂量)给予清肾颗粒水溶液灌胃；氯沙坦组给予氯沙坦钾混悬液(每日13 mg/kg，近似临床等效药量)灌胃。连续给药12周。

2.3 标本留取 将大鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，取出左肾，并将取出的肾组织修剪掉纤维结缔组织，用生理盐水冲洗后，将肾组织迅速放入液氮，并置于-70 ℃冰箱中保存，用于提取P-selectin、PSGL-1蛋白及其RNA。

2.4 观察指标 Western blot法检测肾脏组织中P-selectin及PSGL-1的蛋白表达水平；RT-PCR法检测肾脏组织中P-selectin、PSGL-1 mRNA表达水平。引物序列如下：

P-selectin:5′-CTGAGAACTGGGCAGAC-3′，5′-GGTAGCAGGAGCAGGTGTA-3′，220 bp。

PSGL-1: 5′-CTACCAAAAGAGGTCTGTTCATAC-3′，5′-TGTGCAGGGTGAGGTCATC-3′，395 bp。

3 结果

与正常组比较，模型组P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA相对表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，清肾颗粒各剂量组和氯沙坦组P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与氯沙坦组比较，清肾颗粒高剂量组P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；清肾颗粒各组之间比较，清肾颗粒高剂量组P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平最低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠肾脏组织中P-selectin和PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与氯沙坦组比较，△P<0.05；与清肾颗粒高剂量组比较，◇P<0.05

注：1.正常组；2.模型组；3.清肾颗粒高剂量组；4.清肾颗粒中剂量组；5.清肾颗粒低剂量组；6.氯沙坦组

图1 Western blot法检测各组大鼠P-selectin、PSGL-1表达水平

4 讨论

肾纤维化是CKD的病理基础，其过程是不可逆的，而最终发展结局是终末期肾脏病，因此如何延缓这一过程是亟待解决的关键问题。相关文献表明，肾脏组织炎性病变在肾纤维化发生及进展中起到至关重要的作用[5]。肾单位毛细血管参与血浆滤过和再吸收、组织供氧和营养等重要环节，内皮细胞损伤推动慢性肾脏病发展的进程[6]。而P-selectin是炎症、组织损伤时重要的黏附分子，可通过介导内皮细胞黏附、血小板与白细胞相互作用，参与炎性反应[7]。PSGL-1作为一种重要的炎性分子，主要表达于各种白细胞，是目前被发现的P-selectin中最主要的糖蛋白配体。PSGL-1的作用不但可以促进白细胞的黏附，而且还在激活白细胞的过程中作为信号分子传递信号[8]。内皮细胞上的P-selectin与白细胞上PSGL-1结合，可驱动白细胞在炎症部位血管内皮表面滚动减缓，并通过反复黏附过程，促使白细胞迁移进入炎症局部，参与肾脏纤维化过程的一系列炎性反应，而针对P-selectin及配体的抗黏附干预，可有效抑制纤维化形成及白细胞的炎性浸润。

清肾颗粒为清热化湿、祛瘀泄浊的中药复方，其用于慢性肾衰竭湿热证患者，疗效显著。前期实验研究[9-12]表明，湿热证是慢性肾衰竭患者的主要中医证候，慢性肾衰竭湿热证与肾脏炎症状态及高表达的炎性因子密切相关；具有清热化湿祛瘀功效的中药复方清肾颗粒能够显著降低慢性肾衰竭患者血浆P-selectin水平，发挥其保护肾功能、抗肾脏纤维化的作用。

本次研究结果表明，5/6肾切除大鼠肾组织中P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平明显高于正常组(P<0.05)，经药物干预后，各治疗组大鼠P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达均显著下降(P<0.05)，其中清肾颗粒高剂量组较氯沙坦组显著降低(P<0.05)，清肾颗粒3个剂量组中，高剂量组P-selectin、PSGL-1蛋白及其mRNA表达水平最低(P<0.05)；结果提示清肾颗粒能够降低P-selectin及其配体的蛋白和基因表达，其作用优于氯沙坦，且呈量效关系。清肾颗粒通过从基因转录和蛋白翻译两个方面下调肾组织P-selectin和PSGL-1的表达，从而发挥抗肾脏纤维化作用。