新藤黄酸诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用研究

程 卉，李庆林，侯 梅，苏婧婧

(安徽中医药大学科研实验中心 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但卵巢上皮癌的病死率却占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命及生存质量造成严重威胁[1-3]。化学治疗是卵巢癌首选的治疗方法之一，中药及活性成分运用于抗肿瘤治疗具有悠久的历史，且中药以其药源广泛，不良反应小，价格低廉，易于被患者接受等特点被用于化学治疗的辅助治疗。近年来，从中草药中寻找天然抗肿瘤活性成分已经成为抗癌药物研究的一个重要途径和研究热点。本实验以中药藤黄的主要成分之一——新藤黄酸作为研究药物，探讨其对卵巢癌细胞株A2780的增殖抑制作用及其可能的作用机制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 细胞培养箱：德国Memmert；生物安全柜(BSC-1600IIB2)：江苏省苏净集团；高压蒸汽灭菌锅(GI-36)：福建省厦门致微仪器有限公司；全自动多功能酶标仪(Spectra-Max M2e)：美国MD公司；冷冻离心机：德国eppendorf；流式细胞仪(cytoflex)：美国Beckman cullter；倒置荧光显微镜(DMI-6000B)：德国徕卡公司。

1.2 试剂和药品 新藤黄酸(纯度>98%)：上海源叶生物有限公司；fluo-3AM：江苏省碧云天生物有限公司；Hoechst 33342(货号 B2261)：美国sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/PI双染法试剂盒：江苏省南京凯基生物科技发展有限公司；Caspase-9(批号 16114)：美国Santa Cruz公司；细胞色素C(cytochrome C， Cyt C)(批号 AA43132)：美国Bioworld公司；p53蛋白(批号 GR194170-1)：英国Abcam公司。

2 方法

2.1 MTT检测新藤黄酸对A2780细胞存活率的影响 消化对数生长期A2780，收集细胞，调整细胞密度至5×104/mL，接种至96孔板中，每组对应6个复孔，每组加入100 μL上述悬液。种板24 h后，每孔分别加入1、2、4、8、16、32 μmol/L的新藤黄酸溶液各100 μL，空白对照组加入相同容积的新鲜培养基。将细胞放在培养箱中分别培养24、48 h。待细胞结束培养前4 h，用移液器吸弃旧的培养基，向各孔中加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h，每孔加入DMSO 150 μL，缓慢震摇15 min，充分混合。570 nm波长下，使用多功能酶标仪检测光密度(optical density，OD)，实验至少重复3遍。按照下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%，然后以细胞存活率为纵轴，新藤黄酸浓度为横轴，绘制细胞存活率曲线，计算IC50。

2.2 钙离子水平检测 将A2780细胞以每孔4×105接种于6孔培养板中，置于培养箱中培养过夜，次日向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黄酸，于培养箱中孵育24 h，用PBS轻柔洗涤细胞3次，加入1 μmol/L fluo-3AM染液至终浓度为0.05%，覆盖细胞，置培养箱中孵育30 min，除去fluo-3AM染液， HBSS液洗涤细胞3次，加入HBSS液覆盖细胞，37 ℃培养箱中孵育30 min，于倒置荧光显微镜下488 nm蓝光激发拍照。

2.3 Hoechst 33342染色荧光显微镜观察细胞凋亡 胰酶消化收集的A2780细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为6×104/mL，接种于6孔培养板中，每孔3 mL，于37 ℃ CO2培养箱中培养24 h。向各孔中加入2、4、8 μmol/L新藤黄酸溶液，平行设空白对照组，于37 ℃ CO2培养箱中继续培养24 h。预冷的PBS缓冲液轻柔冲洗细胞2次，向各孔中加入2 mL多聚甲醛固定液固定20 min，预冷的PBS缓冲液轻柔冲洗细胞2次，各孔中加入1 mL含Hoechst 33342(终浓度为20 μg/mL)的PBS缓冲液，37 ℃避光孵育10 min，弃去染液，PBS冲洗，各孔加入1 mL PBS后于倒置荧光显微镜下采用紫外激发观察并拍照。

2.4 新藤黄酸对A2780细胞周期的影响 将A2780细胞以每孔8×105接种于50 mL培养瓶中，置于培养箱中培养过夜，次日向各瓶中加入2、4、8 μmol/L新藤黄酸，于培养箱中孵育24 h，胰酶消化离心收集细胞，4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，弃去上清液。用-20 ℃预冷的70%乙醇点动离心混匀固定细胞，避光放置于4 ℃冰箱24 h后，离心弃去上清，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，按说明书操作，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色10 min后，用流式细胞仪检测细胞周期分布。

2.5 新藤黄酸对A2780细胞凋亡率的影响 将卵巢癌细胞A2780细胞接种于50 mL培养瓶中，37 ℃培养箱中孵育过夜后，各瓶中分别加入2、4、8 μmol/L新藤黄酸，培养箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min离心5 min并收集细胞，4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，弃去上清液，各组分别加入400 μL预冷的1×结合缓冲液，分别加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI溶液，混匀细胞，避光孵育15 min后，1 h内上机检测。同时设阴性对照管和单标补偿调节管，采用FC500流式细胞仪自带功能软件进行分析。

2.6 Western blot检测新藤黄酸对A2780细胞凋亡相关蛋白表达的影响 各组细胞经胰酶消化收集后，用4 ℃预冷的PBS洗涤2次，再加入含PMSF的RIPA细胞裂解液(强)，置于冰上孵育10 min，12 000 r/min离心10 min收集上清于EP管中，加入上样缓冲液后，100 ℃煮10 min，置于-20 ℃保存。蛋白定量后，每组上样2.5 μg进行SDS-PAGE电泳分离，待电泳结束后湿转到NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应的一抗(兔抗，稀释倍数均为1∶1 000)，置于摇床中4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，每次5 min，共3次；与对应的二抗(山羊抗兔1∶10 000)室温下孵育1 h后，TBST洗膜，每次5 min，共3次。化学发光显色试剂盒显色，置于凝胶成像仪上拍摄。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 MTT检测新藤黄酸对A2780细胞存活率的影响 本研究采用浓度分别为1、2、4、8、16、32 μmol/L新藤黄酸处理卵巢癌A2780细胞24、48 h后，MTT检测结果可见，与对照组相比，各给药组细胞存活率随着新藤黄酸浓度的增高而降低，且呈现明显的量效和时效关系。实验结果计算得出新藤黄酸作用A2780细胞24 h的IC50值为7.648 μmol/L，48 h的IC50值为6.426 μmol/L。见图1。

图1 新藤黄酸对A2780细胞存活率的影响

3.2 Fluo-3AM染色法观察新藤黄酸对A2780细胞钙离子水平的影响 Fluo-3AM染色荧光显微镜下观察胞内钙离子的水平，结果显示：空白对照组在视野下呈现均一而暗淡的绿色荧光，而新藤黄酸2 μmol/L组与空白对照组相比绿色荧光强度增强，新藤黄酸4 μmol/L和8 μmol/L组细胞呈现明亮的绿色荧光，且具有明显的浓度依赖性。见图2。

注：A.空白对照组；B.2 μmol/L新藤黄酸组；C.4 μmol/L新藤黄酸组；D.8 μmol/L新藤黄酸组

图2 Fluo-3AM染色法观察新藤黄酸对A2780细胞钙离子水平的影响(10×20倍)

3.3 Hoechst 33342检测新藤黄酸对A2780细胞损伤的影响 Hoechst 33342染色倒置荧光显微镜下观察发现，空白对照组细胞在镜下呈现均一且暗淡的蓝色荧光，而新藤黄酸2、4、8 μmol/L组随着药物浓度的增加，蓝色荧光的强度逐渐增强，表明新藤黄酸可以诱导A2780细胞发生凋亡，且呈现一定的浓度依赖性。见图3。

注：A.空白对照组；B.2 μmol/L新藤黄酸组；C.4 μmol/L新藤黄酸组；D.8 μmol/L新藤黄酸组

图3 Hoechst 33342染色观察新藤黄酸对A2780细胞损伤的影响(10×20倍)

3.4 流式细胞仪检测新藤黄酸对A2780细胞周期的影响 与正常对照组相比，新藤黄酸2、4、8 μmol/L组均表现出G0/G1期阻滞，S期细胞比例显著减少，且在2、4 μmol/L呈现一定的浓度依赖关系,以上结果表明新藤黄酸能诱导A2780细胞发生G0/G1期阻滞。见图4。

3.5 流式细胞仪检测新藤黄酸对A2780细胞凋亡率的影响 正常对照组细胞凋亡率在5%左右，细胞状态良好，与正常对照组相比，新藤黄酸2、4、8 μmol/L组细胞凋亡率分别为(6.9±1.1)%、(13.4±3.7)%、(18.3±5.2)%，细胞凋亡率呈现浓度依赖性升高，结果表明新藤黄酸能诱导A2780细胞凋亡。见图5。

注：A.空白对照组；B.2 μmol/L 新藤黄酸组；C.4 μmol/L新藤黄酸组；D.8 μmol/L新藤黄酸组

图4 流式细胞仪检测新藤黄酸对A2780细胞周期的影响

注：A.空白对照组；B.2 μmol/L新藤黄酸组；C.4 μmol/L新藤黄酸组；D.8 μmol/L新藤黄酸组

图5流式细胞仪检测新藤黄酸对A2780细胞凋亡率的影响

3.6 Western blot检测新藤黄酸对A2780细胞凋亡相关蛋白表达的影响 为了进一步研究新藤黄酸诱导A2780细胞凋亡的机制，实验检测不同浓度新藤黄酸作用细胞24 h后Cyt C、Caspase-9和p53蛋白的表达，实验结果表明新藤黄酸作用A2780细胞后随着药物浓度的增加，Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表达水平呈浓度依赖性升高。见图6。

注：与0 μmol/L新藤黄酸组比较，*P<0.05

图6新藤黄酸对A2780细胞内Cyt C、Caspase-9和p53蛋白表达的影响(Western blot法)

4 讨论

藤黄是藤黄科植物藤黄的干燥树脂，黄褐色且带有蜡样光泽，其具有攻毒蚀疮、止血、杀虫之功效，临床用于顽癣湿疮、无名肿毒、出血、烫伤以及肿瘤[4]。近年来，藤黄的主要成分新藤黄酸抗肿瘤活性日益受到科研工作者的关注，研究表明新藤黄酸对多种实体瘤细胞及白血病细胞均具有良好的抑制增殖作用，抗肿瘤活性强。本课题组多年研究结果表明，新藤黄酸作用多种肿瘤细胞株24 h的IC50为7.648 μmol/L,且对肺癌等裸鼠移植瘤具有良好的抑制肿瘤增长的效果[5-10]。本实验采用MTT法检测新藤黄酸对卵巢癌A2780细胞存活率的影响，结果表明在1～32 μmol/L范围内新藤黄酸亦能有限降低A2780的存活率，且呈现明显的浓度依赖关系，新藤黄酸作用24 h的IC50为7.648 μmol/L，表现出较强的体外抗肿瘤活性。

线粒体是真核细胞内ATP的产生场所，细胞维持生命活动所需能量的95%均由线粒体提供，其对维持细胞的正常功能起着至关重要的作用[11]。线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一，研究发现线粒体内包含一些与细胞凋亡密切相关的物质，如Cyt C、凋亡诱导因子、Ca2+和活性氧自由基[12-13]。研究表明，Cyt C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤，各种凋亡刺激信号通过Bcl-2同源结构域3蛋白引起Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2-associated protein X,Bax)移位到线粒体外膜并多聚化，形成膜通道，线粒体的膜电位下降，膜通透性增加，刺激线粒体释放Cyt C和第二线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondrial-derived activator of caspase, Smac)，当Cyt C释放到胞内以后，与凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)相互作用，在ATP和dATP的协助下形成凋亡复合体，凋亡复合体通过招募并激活Caspase-9，其进一步激活效应Caspase-3和Caspase-7，启动Caspase级联反应，切割细胞中多种底物，最终导致细胞凋亡[14-15]。

本实验通过Annexin Ⅴ-FITC/PI试验观察新藤黄酸诱导A2780细胞凋亡的作用，实验结果表明新藤黄酸可以诱导A2780细胞发生凋亡；且Fluo-3AM染色结果显示，随着新藤黄酸药物浓度的增加，胞内Ca2+水平也逐渐升高；进一步通过Western blot实验证实新藤黄酸作用细胞后线粒体凋亡相关蛋白Cyt C、p53和Caspase-9蛋白表达水平显著增加；此外，PI单染色流式细胞仪检测结果显示，新藤黄酸能促使A2780细胞周期阻滞于G0/G1期，表明细胞增殖受到抑制。以上结果表明，新藤黄酸能诱导A2780细胞发生线粒体凋亡并且抑制细胞增殖，但其深入的信号转导机制有待进一步的研究。