独活药材香豆素类成分的高效液相色谱指纹图谱研究

王 斌，周 安，杨 沫，刘先华，韩燕全

(1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；3.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

独活始载于《神农本草经》，被列为上品。“主风寒所击，金疮止痛，奔豚痫痉,女子疝瘕，久服轻身耐老。”对其植物来源，历代本草诸说不一[1]。现在所用品种也依地区不同而差异很大。《中药大辞典》共收载了13种之多，直到1959年的《中药志》[2]根据实际调查才逐步理清，独活来源于2科多种植物，主要为川独活类型(来源于当归属植物重齿毛当归AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan)，香独活类型(来源于当归属毛当归A.pubescensMaxim.)，牛尾独活类型(来源于独活属Heracleum植物)及九眼独活类型(来源于五加科植物AraliacordataThunb.)。《中华人民共和国药典》规定独活正品为伞形科植物重齿毛当归的干燥根，临床上主要用于风寒湿痹、腰膝疼痛、少阴伏风头痛等症。现代植物化学提取分离研究已经证实，独活中主要含有伞形花内脂、二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹素等数十种香豆素类化合物[1]。现代药理研究表明，独活有抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用[1，3]。

羌活药材因外观与独活药材相似，市场上常将羌活与独活药材混用。因此，为了保障药材质量，对独活药材的质量控制显得尤为重要。然而，目前对独活药材的质量控制主要集中于药材中几种主要成分的含量测定。如2010年版《中华人民共和国药典》一部[4]以蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯作为独活药材含量检测指标控制药材质量。然而，含有数十种药理活性成分的药材仅通过几个指标成分的含量测定尚不能全面评价药材质量的优劣。鉴于此，笔者在前期研究[3，5]基础上，收集了包括GAP种植基地在内的不同产地的15批独活药材，建立了独活药材香豆素类成分高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱，并对指纹图谱中15个共有峰进行指认与推断，首次从定性角度深入分析独活药材，通过数据化处理并结合相似度评价、模糊聚类分析等方法从整体角度进一步评价，以期能为全面控制该药材的质量提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型HPLC(包括在线脱气机、二元泵、恒温自动进样器、柱温箱、紫外检测器)：美国安捷伦公司；Finnigan Surveyor-LCQ XL二维线性离子阱液质联用仪，质谱(Mass,MSn)配有电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；高效液相色谱仪：美国Thermo Finnigan公司；BP211D型十万分之一电子天平：德国赛多利斯公司；HS10260D型超声清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 试药 对照品蛇床子素(批号 110822-201308)和补骨脂素(批号 110739-201115)：中国食品药品检定研究院；对照品伞形花内酯、佛手柑内酯、花椒毒素、二氢欧山芹醇当归酸酯：天津士兰科技有限公司。2批GAP种植基地独活药材于2014年6月采于湖北省五峰县牛庄乡，11批不同产地独活药材(产地：湖北省、四川省、甘肃省)由安徽省亳州市食品药品检验所刘军检验员收集，2批市售药材购自北京同仁堂合肥药店和立方大药房合肥药店。所购独活药材经安徽中医药大学第一附属医院孟楣主任药师鉴定为重齿毛当归(AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan)的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件 色谱柱为Hypersil ODS XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以水为流动相A、以甲醇为流动相B进行梯度洗脱。洗脱程序：0～10 min，30% B；15～17 min，42% B；20～30 min，52% B；35～45 min，60% B；50～60 min，65% B；65～70 min，70% B。流速为1.2 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为330 nm。采用ESI，喷雾电压为4.0 kV；鞘气为高纯氮气，压力流速为35个单位；碰撞气体为高纯氦气；金属毛细管温度300 ℃；采用正离子方式检测模式，扫描范围从m/z80到m/z800，二级质谱离子隔离宽度2(m/z)，碰撞裂解能量(collision-induce dissociation，CID)为35%。

2.2 对照品溶液的制备 称取对照品伞形花内酯、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、蛇床子素和二氢欧山芹素，精密称定，用甲醇-二氯甲烷(容积比为1∶1)溶解，制成质量浓度分别为0.504、0.916、0.600、0.900、0.571、0.553 mg/mL的对照品储备液，分别取上述标准品0.5 mL于10 mL容量瓶中，定容至10 mL，得混合对照溶液，进样前用0.45 μL微孔滤膜过滤。

2.3 供试品溶液的制备 称取独活药材约20.0 g，经粉碎机粉碎后过180目筛。称取独活药材粉末约2.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，用甲醇与二氯甲烷混合溶液(容积比为1∶1)超声萃取3次，萃取容积依次为30、30、20 mL，每次30 min，滤过，合并提取液，旋干，用甲醇与二氯甲烷混合溶液(容积比为1∶1)溶解，并转移至10 mL容量瓶中，定容，进样前用0.45 μL微孔滤膜过滤。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取S1号供试品溶液(甘肃-1)，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录独活HPLC图谱。结果显示，以蛇床子素峰为参比峰，15个共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.06%～0.31% 和0.28%～1.67%。将这6张色谱图经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004年A版)评价，其相似度均大于0.995，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取S9号供试品溶液(湖北五峰-2)，采用“2.1”项下的色谱条件，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，记录独活HPLC图谱。结果显示15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积(参比峰为蛇床子素峰)的RSD分别为0.02%～0.63%和0.82%～2.29%，将这6张HPLC图谱经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004年A版)评价，其相似度均大于0.994，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.4.3 重复性试验 称取S14号独活供试品(四川-3)6份，每份约2.0 g，按标准方法制备供试品溶液，按上述优化的色谱条件进样10 μL，记录独活的HPLC图谱。结果表明，以蛇床子素峰为参比峰，15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.03%～0.67%和0.62%～2.48%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.4 独活药材特征峰解析 取15批不同产地的独活药材，按标准方法制备样品溶液，并在上述优化的色谱条件下测定样品的HPLC图谱。根据指纹图谱软件处理图谱，自动生成独活药材共有模式的对照图谱，见图1。确定了15个色谱峰作为共有特征色谱峰，并对其进行HPLC-ESI-MSn分析，各峰的质谱信息见表1。通过对照质谱信息和保留时间，指认了其中的6个峰，通过质谱信息并结合文献报道[6-12]，推断了15个特征峰中的另外9个峰。

注：1.腺苷；2.伞形花内酯；3. 3-O-反式阿魏酰基奎宁酸；4.紫花前胡苷；5.二氢欧山芹醇；6.补骨脂素；7.花椒毒素；8.异当归醇；9.佛手柑内酯；10.欧芹烯酚；11.二氢欧山芹醇乙酸酯；12.川白芷素；13.当归三醇；14.蛇床子素；15.二氢欧山芹醇当归酸酯

图1混合对照品色谱图(A)和独活药材的共有模式图(B)

2.5 指纹图谱建立及分析评价

2.5.1 参比峰的选择 从15批次独活样品的HPLC图谱中可知，14号蛇床子素色谱峰峰面积最大，保留时间稳定，且为独活的主要活性成分，所以选择其作为参照峰(即S峰)。

2.5.2 独活药材HPLC指纹图谱的建立 将每个样品的AIA格式文件导入相似度评价软件，以湖北省五峰县牛庄乡GAP种植基地样品(S9号，湖北五峰县-2)为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度设为0.1 min且对色谱图上保留时间在5～65 min时间段的色谱峰进行分析，选定了15个色谱峰进行多点校正，自动匹配，最终获得了15个共有特征峰，见图2。表2为不同产地独活药材的相似度数据。

表1 独活样品中15个共有峰的HPLC-ESI(+)-MSn数据及鉴定

注：tR(retention time)为保留时间；*表示与标准品进行对照

图2 15批独活药材HPLC指纹图谱叠加图

样品编号样品名称相似度样品编号样品名称相似度S1甘肃-10.908S9湖北五峰-20.975S2甘肃-20.950S10市售-立方药业0.874S3甘肃-30.925S11市售-北京同仁堂0.844S4甘肃-40.944S12四川-10.899S5湖北-10.963S13四川-20.848S6湖北-20.977S14四川-30.922S7湖北恩施0.979S15四川-40.797S8湖北五峰-10.974

2.5.3 独活药材聚类分析 以15个共有峰的峰面积作标，运用SPSS 16.0软件，采用组间平均数联结法，样品相似度的距离公式选择夹角余弦，对15个批次独活样品进行系统聚类，得到聚类树状图。从聚类分析结果可知，15批独活样品被聚为五类，S1、S14聚为Ⅰ类；S2、S4、S7、S9聚为Ⅱ类；S3、S5、S8聚为Ⅲ类；S6、S10、S11聚为Ⅳ类；S12、S13、S15聚为Ⅴ类。

2.5.4 共有峰主成分分析 用SPSS 16.0统计分析软件对原始数据作标准化处理，以主成分的特征根及贡献率作为选择主成分的依据进行主成分分析。取主成分对应的特征值大于1的前4个主成分，对15个样品(观测对象)的15个共有峰(变量)进行主成分分析，结果显示4个主成分累计贡献可以达到89.854%。其中第一、第二、第三和第四主成分特征值分别为7.253、2.718、1.951和1.556，相应的方差贡献率分别为48.357%、18.119%、13.005%和10.374%。分别以第一、第二、第三主成分来建立坐标系，进行投影后可得到所有样本的主成分分析三维投影图，结果显示15个共有峰可大致分为3类。经旋转后得到公共因子载荷矩阵，每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数，再经SPSS 16.0软件计算可得主成分模型，从上述主成分模型可以看出，4个主成分中，A1是特征值最大的峰。第一主成分中前5名变量系数分别为0.330、0.275、0.214、0.202和0.121，分别为指纹图谱中的13号色谱峰(当归三醇)、5号色谱峰(二氢欧山芹醇)、10号色谱峰(欧芹烯酚)、11号色谱峰(二氢欧山芹醇乙酸酯)和14号色谱峰(蛇床子素)；系数的大小反映指标成分贡献率的大小。

3 讨论

3.1 共有峰的鉴定 取“2.3”项下的独活提取液10 μL进行HPLC-ESI-MSn多级质谱分析。本实验关注的成分主要是香豆素类，为苯并吡喃酮结构。香豆素化合物在进行HPLC-MSn分析时易产生丢失m/z28(CO)或m/z44(CO2)的碎片离子。本实验结合前期研究，运用香豆素化合物的HPLC-ESI-MSn裂解规律，对未知峰的多级质谱信息进行分析并结合6个标准品信息，在独活的植物化学提取相关文献报道的基础上，鉴定了全部共有峰。1号峰，tR=8.389 min， 正离子模式可见m/z268[M+H]+，分子中应含有奇数氮原子，将[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失132的核糖基碎片而产生m/z136离子，结合文献[6]报道推测为腺苷。3号峰，tR=20.755 min，正离子模式可见m/z369[M+H]+，对该[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失192的碎片产生m/z177离子，将m/z177离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失CO产生m/z145和m/z117离子，结合文献[6]报道推测为3-O-反式阿魏酰基奎宁酸。4号峰，tR=22.319 min，正离子模式可见m/z409[M+H]+，对该[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失162的葡萄糖基碎片产生m/z247离子，后将m/z247离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失H2O和C3H6产生m/z229和m/z187离子，结合文献[7]报道推测为紫花前胡苷。5号峰，tR=24.378 min，正离子模式可见m/z247[M+H]+，将[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失水分子产生m/z229离子，再将m/z229离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失CO产生m/z201和m/z173离子，结合文献[8]报道推测为二氢欧山芹醇。8号峰，tR=29.545 min，正离子模式可见m/z377[M+H]+，将[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失18 Dau的水分子产生m/z359离子，再将m/z359离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失CH3COCH3、C5H6O和CO产生m/z301、m/z219和m/z191离子，结合文献[9]报道推测为异当归醇。10号峰，tR=39.325 min，正离子模式可见m/z231[M+H]+，对该[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失C4H8的丁烯碎片产生m/z175离子，后将m/z175离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失CO和CO2产生m/z147和m/z103离子，结合文献[10]报道推测为欧芹烯酚。11号峰，tR=41.647 min，正离子模式可见m/z289[M+H]+，对该[M+H]+峰进行MS2分析，产生m/z229的川白芷素型特征离子，对该m/z229离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失C3H6和CO产生m/z187和m/z159离子，结合文献[10]报道推测为二氢欧山芹醇乙酸酯。12号峰，tR=46.575 min，正离子模式可见m/z229[M+H]+，对该[M+H]+峰进行MS2分析，通过丢失C3H6的丙烯碎片产生m/z187离子，对该m/z187离子进行MS3和MS4分析，通过连续丢失CO产生m/z159和m/z131离子，结合文献[11]报道推测为川白芷素。13号峰，tR=48.860 min，正离子模式可见m/z295[M+H]+，对[M+H]+峰进行MS2、MS3和MS4分析，结果显示，通过连续丢失H2O产生m/z277，m/z259和m/z241离子，结合文献[12]报道推测为当归三醇。

3.2 相似度评价 15批相似度为0.797～0.979。其中2批市售独活药材(S10，S11)与3批四川产地独活药材(S12，S13，S15)相似度小于0.900，4批样品(S1，S3，S4，S14)的相似度为0.908～0.950，6批样品(S2，S5，S6，S7，S8，S9)的相似度大于0.950。以上数据反映不同来源的独活药材的质量间存在一定的差异。甘肃和湖北产地的药材具有较高的均一性。

3.3 聚类分析 聚类分析是根据相似度大小将样品归类。从聚类分析结果可知，市售药材(S10和S11)聚为一类，而产地相近的药材并未全部聚为一类，如四川产地药材(S12，S13，S15)聚为一类，而甘肃产地(S2，S4)和湖北产地(S7，S9)药材交叉聚为一类。值得一提的是，同为GAP种植基地药材(S8和S9)却未能聚为一类，这些差异性表明，地理环境中的土壤酸碱度、光照时间、水分以及药材的采收季节等因素可能会对独活中化学成分的含量变化产生一定影响。聚类分析结果与相似度结果基本一致。

3.4 主成分分析 在中药材鉴别方面，主成分分析方法有较多应用。本实验选取15个主要色谱峰的相对峰面积作为变量(将蛇床子素的峰设为参照峰)，根据主成分分析法的降维对独活药材的HPLC指纹图谱数据快速分析，不仅能判别药材的真伪与优劣，还可以作为独活药材质量检测的一种手段。

3.5 真伪药材鉴别 常艳旭等[13]报道了独活的指纹图谱研究，主要侧重于对指纹图谱方法的建立及含量测定，而本实验在建立独活指纹图谱的基础上，采用相似度分析、聚类分析、主成分分析和HPLC-MSn分析对独活指纹图谱进行更深入的定性研究，并将市售药材和GAP种植基地药材纳入指纹图谱评价范围内，应用范围更广。在与独活混品羌活的对比研究中发现，独活药材中峰面积最大的蛇床子素峰和二氢欧山芹素峰在羌活药材中几乎未被发现，由此可将本实验所建立的指纹图谱用于独活与其混品的鉴别。

本实验首次采用指纹图谱结合HPLC-ESI-MSn、聚类分析等方法对包括GAP种植基地在内的15批独活药材进行质量评价，建立了独活药材香豆素类成分的HPLC指纹图谱，选取15个共有特征峰进行分析，采用对照品、LC-MS信息和文献报道等多手段对共有峰进行指认和推断，主要包括1个腺苷和14个香豆素类成分，首次从定性角度深入分析独活药材。单纯的中药指纹图谱由于缺乏对指纹峰化学信息的了解而不能反映中药的药物活性。因此，本研究从指纹图谱的整体性入手，为独活的质量评价以及临床应用提供更完善的依据。

(致谢：北京大学杨秀伟教授和湖北省中医药研究院王克勤研究员在采购GAP种植基地独活药材上给予了热心帮助，安徽省亳州市食品药品检验所刘军检验员帮助收集不同产地独活药材，在此一并感谢！)