儿童呼吸道感染流感嗜血杆菌的耐药性分析及复合感染特点

胡琼 莫丽亚 李先斌 黄彩芝 刘健龙

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，HI）是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌。有研究指出，HI是我国儿童发生社区获得性肺炎的一种重要病原菌，仅次于肺炎链球菌，可引起肺炎、支气管炎、化脓性脑膜炎、脓毒症等多种疾病，严重威胁儿童的身体健康[1-2]。由于HI是专性寄生的苛养性细菌，常伴随其他细菌而生长，给分离培养带来困难，基于鉴定条件及耐药机制复杂，HI的分布和耐药性具有地域性差异。因此，本研究对湖南省儿童医院呼吸道感染患儿痰液标本分离出的病原菌进行分析，以了解本地区儿童HI感染及复合感染情况，持续监测耐药性变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集本院2018年6月—2019年5月因呼吸道感染住院患儿送检的合格痰标本共计36 452份。送检的痰标本先行涂片镜检，如果白细胞＞10个/LP而鳞状上皮细胞＜25个/LP的标本则视为合格标本。

1.2 培养基及试剂盒 嗜血杆菌分离培养基和哥伦比亚血琼脂平板均购自郑州人福博赛生物公司；VITEK MS及配套的质谱靶板购自法国生物梅里埃公司；嗜血杆菌专用药敏板购自湖南天地人生物公司；7项呼吸道病毒检测试剂盒购自上海贝西生物科技有限公司。

1.3 细菌的分离培养和鉴定 痰标本经离心镜检后，取沉淀分别接种于哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯琼脂平板（Mac平板）、嗜血杆菌专用巧克力平板,置5% CO2培养箱35 ℃培养18～24 h。挑取HI或其他病原菌，用质谱仪VITEK MS鉴定，并用药敏板进行药敏试验；呼吸道病毒用专用试剂盒检测；嗜血杆菌专用药敏板自带β-内酰胺酶检测。

1.4 标准菌株 HI ATCC 49247。

1.5 药敏试验 用配套稀释液配成1.0麦氏标准的菌液上药敏板，置于35 ℃培养箱培养18～24 h，上机检测。

1.6 统计学分析 将检测数据录入WHONET 5.5软件，对菌株分布和药敏结果进行统计分析。

2 结果

2.1 细菌检出情况 36 452份痰标本共检出HI 2 974株，阳性率8.16%；其中有552株（18.56%）同时检出其他病原菌，分别是肺炎链球菌266株（占48.19%）、肠杆菌科菌112株（占20.29%）、金黄色葡萄球菌81株（占14.67%）、非发酵杆菌59株（占10.69%）、其他菌株34株（占6.16%）。

2.2 病毒检出情况 在本次检出2 974株HI的痰标本中，有2 682份标本同时进行了病毒检测，共计检出病毒1 093株（40.75%），分别是合胞病毒499株（占45.65%）、副流感病毒281株（占25.71%）、流感病毒229株（占20.95%）、腺病毒84株（占7.69%）。

2.3 药物敏感试验结果 对2 974株HI中的2 708株HI进行了药物敏感试验，结果显示：HI对第三代头孢菌素、哌拉西林/他唑巴坦和氟喹诺酮类药物均表现出良好的体外活性，而对复方新诺明、氨苄西林和氨苄西林/舒巴坦的耐药率较高。见表1。

表1 2 708株HI对抗菌药物的药敏结果

2.4 HI耐药机制情况 药敏测试板显示，2 708株HI中有1 060株产β-内酰胺酶，均对氨苄西林耐药；β-内酰胺酶阳性阿莫西林/克拉维酸耐药（BLPACR）型HI检出183株；β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药（BLNAR）型HI检出779株，且对头孢呋辛和氨苄西林/舒巴坦耐药。见表2。

表2 2 708株耐药机制不同的HI分布情况

3 讨论

3.1 HI是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌。有研究表明，HI可以通过黏附侵入呼吸道上皮细胞，又通过外膜蛋白的改变逃脱中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬，从而在呼吸道长期定植[3-4]并继发下呼吸道感染，除此之外还可引起化脓性脑膜炎、蜂窝组织炎、关节炎及骨髓炎等原发或继发性感染。本研究结果显示，2018年6月—2019年5月本院从呼吸道感染患儿中共检出HI 2 974株，检出率8.16%，低于杨晓华等[5]报道的10.2%。分析其可能的原因是：HI的分布可能存在一定的地域和季节差异；但最主要的原因还是由于HI属于苛养性细菌，生长需要Ⅴ、Ⅹ因子，在一般巧克力平板上菌落小，不易识别，加上革兰阳性（G+）球菌的干扰，生长速度慢，临床上容易漏检；而使用加了万古霉素等药物的巧克力培养基，生长的嗜血杆菌菌落较大，且能抑制G+球菌的生长，会更容易识别。因此，只有不断提高检验水平和检验技术，才能提高HI的检出率。

3.2 本研究显示，检出HI的呼吸道感染患儿中，有18.56%的患儿同时检出其他细菌，以肺炎链球菌多见。有文献指出，HI与肺炎链球菌存在共生关系，共同在呼吸道感染致病中发挥协同作用[6]。此外，本研究病毒检测结果显示，2 682份HI标本中有1 093份同时检出了病毒，检出率达40.75%，主要是合胞病毒，其中有6株同时合并2种呼吸道病毒，1株同时合并3种呼吸道病毒。可能是因为当呼吸道感染病毒时，由于病毒的侵入造成上皮细胞变性、坏死，使HI的继发感染有了可趁之机，而当呼吸道感染HI时，其炎症反应也利于病毒的侵入。可见，儿童感染HI时可合并感染多种病原体。国内还有研究表明，患儿细菌合并病毒感染比单一细菌感染或单一病毒感染的临床症状更加严重，病程更长，并发症更多[7]。因此，本研究提示，临床医师要提高对患儿复合感染发生率的认知，尽量避免患儿临床治疗效果不佳、预后不良等情况的发生。

3.3 本研究药敏结果显示，HI对氨苄西林的耐药率为 67.91%，比甄杨等[8]报道的 52%、徐和平等[9]报道的28.4%及陶云珍等[10]报道的32.7%都高，而氨苄西林和阿莫西林是治疗HI感染最常用的药物，但由于耐药率逐年升高，不宜作为临床经验用药。

3.3.1 HI的耐药机制主要是细菌产生β-内酰胺酶（TEM-1型或ROB-1型），水解氨苄西林使其失活。本研究中有1 060株HI产β-内酰胺酶，占39.14%，提示本地区产β-内酰胺酶是导致HI对氨苄西林耐药的主要机制。

3.3.2 本研究还显示，HI对氨苄西林耐药还有另一机制，即氨基酸位点突变引起青霉素结合蛋白改变，产生BLNAR型HI。本研究发现有779株BLNAR型HI，说明BLNAR型HI在本地区是大量存在的，而其耐药机制与以往不同，是HI耐药模式的一种新表现，原因还有待进一步研究。

3.3.3 除了存在β-内酰胺酶耐药机制外，还存在PBPs基因突变的BLPACR型HI，本研究检出183株此类HI。

3.3.4 此外，谢成彬等[11]发现，非产酶HI的基因突变对氨苄西林和第二代头孢菌素影响较大，而对第三代头孢菌素影响较小，对非β-内酰胺类抗菌药物影响很小。本研究中HI对环丙沙星和利福平等的敏感率均为100%，第三代头孢菌素敏感率也达98%以上，几乎不受青霉素结合蛋白改变的影响。

3.3.5 本研究还表明，抗菌药物中复方新诺明的耐药率仅次于氨苄西林，其耐药机制主要是染色体介导的二氢叶酸还原酶过量产生,导致与甲基苄氧嘧啶的结合减少所致。

3.3.6 另外，阿奇霉素是新一代大环内酯类抗菌药物，对HI有较强的抗菌活性[12]。但本研究中阿奇霉素耐药率也有26.00%，这可能与儿童用药种类有限、临床将其作为儿童呼吸道感染常用药物等因素有关。随着抗菌药物的广泛使用，耐药率不断升高，本研究提示临床应慎重选择此药。

综上所述，HI是儿童呼吸道感染的重要病原菌。肺炎链球菌、呼吸道病毒常合并HI造成儿童呼吸道感染，当检出HI时应警惕其他复合病原菌或呼吸道病毒的感染。HI对哌拉西林/他唑巴坦、第三代头孢菌素、利福平等有高的敏感率，而对氨苄西林、复方新诺明、氨苄西林/舒巴坦有较高的耐药率，尤其是BLNAR型和BLPACR型HI菌株的大量出现，使儿童HI感染控制面临挑战。因此应当加强耐药监测，指导临床合理使用抗菌药物，延缓耐药菌株的增长，从而为临床提供更全面的诊疗依据。