Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合特性

李 婷，张淑臣，申晓鸿，师光禄，刘京国*

(北京农学院a.植物科学技术学院，b.生物科学与工程学院/农业部华北都市农业重点实验室，北京 102206)

Vip3A毒素是一种由苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生并分泌到细胞外的蛋白。它对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性，并且对小地老虎(Agrotisypsilon)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)等对Cry1A毒素不敏感的害虫具有较高的杀虫活性[1,2]。由于Vip3A毒素与Cry1A毒素之间没有氨基酸序列同源性，不存在竞争结合敏感昆虫上的受体蛋白，它们的杀虫机理不同[1,3-7]。将Vip3A毒素和Cry1A毒素联合使用，既能扩大Cry1A毒素的杀虫谱，又能延缓敏感昆虫对Cry1A毒素抗性的产生。

摄入Vip3A前毒素后，昆虫中肠内的蛋白酶会将Vip3A毒素活化。Vip3A活化后产生62 kDa的大片段和22 kDa的小片段，而且这两个片段依然结合在一起[8,9]。活化后的Vip3A能在体外形成四聚体，并在BBMVs(Brush Border Membrane Vesicles)上形成孔道，而且这种孔道的形成是pH依赖性的[9,10]。与Cry毒素在高pH条件下形成孔道不同，Vip3A在pH8.0时，孔道活性最大，在pH10.0时则没有活性[10]。在体外试验中，Vip3A前毒素既能被敏感昆虫中肠汁液和胰蛋白酶活化，又能被非敏感昆虫中肠汁液活化[3,11]，但是不同昆虫中肠汁液对Vip3A的活化速率是不同的[11-13]。活化对于Vip3A毒素发挥杀虫活性是必须的，因为只有活化的Vip3A毒素能在敏感昆虫BBMVs上形成孔道，而前毒素则不能[3]。并且活化的Vip3A只能在敏感昆虫中肠BBMVs上形成孔道，而不能在非敏感昆虫中肠BBMVs上形成孔道[3]，这表明，活化后的Vip3A与BBMVs的结合是发挥其杀虫活性的关键步骤。毒理试验结果显示，Vip3A与BBMVs上的蛋白结合后，会引起中肠上的杯状细胞和柱状细胞与基底膜脱离、破碎[14]；Vip3A处理敏感昆虫后会引起上皮细胞凋亡，从而导致昆虫死亡[15，16]。

尽管Vip3A与敏感昆虫中肠上蛋白的结合是发挥杀虫活性的关键，但是目前尚未确定中肠上皮细胞上哪些蛋白参与Vip3A的杀虫过程。配体印迹试验结果显示，Vip3A毒素在烟草天蛾BBMVs上能结合分子量分别为80 kDa和100 kDa的蛋白[3]，在灰翅夜蛾(Spodopteramauritia)BBMVs上能结合分子量分别为55 kDa 和100 kDa 的蛋白[4]。遗憾的是，这些蛋白还未得到鉴定。

在本文中，利用制备的Vip3Aa10前毒素和活化的毒素，分析它们对甜菜夜蛾的杀虫活性，与BBMVs的结合特性以及在BBMVs上的结合蛋白。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验中所用的含pET28a-Vip3Aa10的E.coli(λDE3)菌株为实验室原有。甜菜夜蛾购买于河南省济源白云实业有限公司，Protease Inhibitor Cocktail Tablets购自Roche公司，Ni Sepharose购自GE公司，化学发光检测试剂购自北京全式金生物有限公司，其他所用常规试剂购自北京畅华科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Vip3Aa10蛋白的表达纯化和活化 将含pET28a-Vip3Aa10的E.coli(λDE3)接种到20 mL含Kan的LB培养基中，37℃，150 r/min培养过夜，第2天转接到1 L含Kan的 LB培养基中，37℃，150 r/min培养，待OD600nm达到0.6左右时，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG，在25℃，110 r/min条件下诱导表达6 h，离心收集菌体。用裂解缓冲液(25 mmol/L Tris-Cl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)悬浮菌体，加入溶菌酶、PMSF 和终浓度为1% Triton X-100，冰浴搅拌至溶液变黏稠，超声破碎后，补加PMSF，然后4℃ 15 000 r/min 离心20 min，上清与用裂解液预平衡的琼脂糖凝胶Ni 在4℃混合30 min，然后用含50 mmol/L咪唑的高盐缓冲液(25 mmol/L Tris-Cl，1 000 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)洗涤3个柱体积。最后用含高浓度咪唑的洗脱缓冲液(25mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0)洗脱目的蛋白。亲和层析提取后的目的蛋白再用离子交换层析纯化，用NaCl浓度梯度洗脱。收集目标蛋白组分，并用洗脱缓冲液透析，然后用考马斯亮蓝法测定蛋白。

分别用0.01%、0.10%、1.00%、10.00%、25.00%、100.00%的胰蛋白酶(wt/wt)在37℃活化10 μg Vip3Aa10蛋白1 h，加入终浓度为4 mmol/L AEBSF室温放置10 min，终止反应，然后加入上样缓冲液，煮沸5 min，SDS-PAGE电泳检测。

用2%胰蛋白酶(wt/wt)大量处理Vip3Aa10，然后用离子交换层析纯化，用NaCl浓度梯度洗脱。收集目标蛋白组分，用洗脱缓冲液透析，然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

1.2.2 甜菜夜蛾BBMVs的制备 取4-5龄幼虫放于冰上15 min，纵向解剖，取出中肠并清除中肠内容物，然后用预冷的0.9% NaCl清洗中肠，吸干水称重，-80℃保存备用。取大约1 g中肠，加9倍体积的缓冲液A(17 mmol/L Tris-Cl，300 mmol/L Mannitol，5 mmol/L EDTA，pH 8.0)和1片蛋白酶抑制剂，用匀浆器充分匀浆。向匀浆液中加入等体积的24 mmol/L MgCl2，充分混匀，于冰浴中静置15 min，然后4℃，3 000 r/min 离心15 min，弃沉淀，上清进一步离心，30 000 r/min，30 min，4℃，弃上清，沉淀用缓冲液B(25 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 8.0)悬浮。测定浓度后在-80℃保存。

1.2.3 Vip3A蛋白与甜菜夜蛾BBMVs的结合 用170 μL不同pH的缓冲液分别与25 μg甜菜夜蛾BBMVs或黄粉虫BBMVs混匀，然后依次加入20 μL蛋白酶抑制剂和2 μg Vip3Aa10-T，室温孵育1 h后，30 000 r/min，4℃，离心30 min，用200 μL 缓冲液洗涤2次，沉淀用上样缓冲液悬浮，煮沸5 min。

用2%胰蛋白酶(wt/wt)在37℃处理Vip3Aa10 1 h。用170 μL缓冲液(50 mmol/L Na2CO3，100 mmol/L NaCl，0.2% β-ME，pH 9.0)与25 μg甜菜夜蛾BBMVs混匀，再与2 μg活化的Vip3Aa10(总体积为200 μL)在室温孵育1 h后，30 000 r/min，4℃，离心30 min；用200 μL缓冲液洗涤2次，沉淀用上样缓冲液悬浮，煮沸5 min。

样品经SDS-PAGE电泳后，转到硝酸纤维素膜上。先用脱脂奶粉封闭过夜，然后依次与Vip3Aa10的抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体孵育，最后用化学发光法检测。

1.2.4 Vip3Aa10-T蛋白在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白 将1 mg Vip3Aa10-T(1mg/ml)在pH8.0碳酸钠缓冲液中透析后，与32 μL 10 mmol/L的NHS-biotion混匀，冰浴标记2 h，然后用PBS透析，测浓度后于-20℃保存。

取40 μg 甜菜夜蛾BBMVs与上样缓冲液混匀，煮沸5 min，经SDS-PAGE电泳后转到硝酸纤维素膜上。先用牛血清白蛋白封闭2 h，然后依次与生物素标记的Vip3Aa10-T、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，最后用化学发光法检测。

1.2.5 生物活性测定 制备甜菜夜蛾人工饲料，分装于24孔板中。用PBS稀释蛋白至0.04、0.20、1.00和5.00 μg/mL。然后将不同浓度的蛋白加在饲料表面，每个孔100 μL，每个蛋白浓度做3组孔板，晾干。将刚孵化出的一龄幼虫放入24孔板中，每孔一头，7 d后统计数据，用SPSS软件计算出LC50。

2 结果与分析

2.1 Vip3Aa10的制备与活化

在构建pET28a-Vip3Aa10质粒时，Vip3Aa10的N端融合His×6标签，在E.coli中表达的Vip3Aa10可以用亲和纯化的方法制备，然后用离子交换层析进一步纯化，得到分子量为90 kDa的His-Vip3Aa10(图1A)。

为了优化制备活化的Vip3Aa10的条件，用不同浓度的胰蛋白酶处理Vip3Aa10，随着胰蛋白酶浓度的升高，90 kDa的His-Vip3Aa10逐渐减少，62 kDa的片段逐渐增多。在1%(wt/wt)胰蛋白酶浓度下，His-Vip3Aa10基本活化成62 kDa的片段(图1B)。为保证Vip3Aa10活化完全，后续用2%(wt/wt)的胰蛋白酶处理Vip3Aa10，并用离子交换层析进一步纯化，得到活化的Vip3Aa10(图1C泳道2)。

2.2 Vip3Aa10对甜菜夜蛾杀虫活性测定

活化的Vip3A的杀虫活性高于Vip3Aa前毒素[17]。尽管活化的Vip3Aa10对甜菜夜蛾的LC50要低于Vip3Aa10前毒素，但是，若考虑置信区间，两者的杀虫活性没有显著变化。同时，这也说明，活化的Vip3Aa10与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾同样具有杀虫活性(表1)。

表1活化的Vip3Aa10与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾的杀虫活性

Tab.1ThetoxicityofactivatedVip3Aa10andVip3Aa10protoxinsagainstS.exigua

毒素toxinsLC50/(ng·cm-2)95%置信区间/(ng·cm-2)95% Fiducial limitHis-Vip3Aa1013.3599.447～17.853Activated Vip3Aa106.0952.336～10.179

2.3 Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs的结合

活化的Vip3A只能结合敏感昆虫中肠BBMVs。为了验证活化的Vip3Aa10能否与甜菜夜蛾中肠BBMVs结合，先用2%(wt/wt)胰蛋白酶处理Vip3Aa10，然后与甜菜夜蛾中肠BBMVs共育，用免疫印迹检测Vip3Aa10。尽管SDS-PAGE电泳后检测不到胰蛋白酶处理后的Vip3Aa10前毒素(图1B)，但是免疫印迹结果显示，仍有小部分Vip3Aa10前毒素没有被完全活化(图2A泳道3)。从泳道4中可以看出，活化后的62 kDa Vip3Aa10能与甜菜夜蛾BBMVs结合(图2A)。泳道4中Vip3Aa10前毒素与活化后的Vip3Aa10的比例显著高于泳道3，这说明，Vip3Aa10前毒素比活化的毒素更容易与BBMVs结合。

注：A为Vip3Aa10经亲和层析和离子交换层析的结果。泳道1-9为离子交换层析时用不同NaCl浓度梯度洗脱的目的蛋白。B为Vip3Aa10蛋白的活化。泳道1为Vip3A蛋白；泳道2-7分别用0.01%、0.10%、1.00%、10.00%、25.00%、100.00%的胰蛋白酶(wt/wt)在37℃活化Vip3Aa10 1 h，然后加入AEBSF，室温放置10 min终止反应，SDS-PAGE电泳检测。C为纯化后Vip3Aa10和活化的Vip3Aa10。泳道1为Vip3Aa10蛋白；泳道2为活化的Vip3Aa10蛋白。M为低分子量蛋白marker。Note:A-The purification of Vip3Aa10 by affinity chromatography and ion exchange chromatography. Lanes 1-9: target proteins eluted with different concentration gradients of NaCl during ion exchange chromatography. B-The activation of Vip3Aa10 protein. Lane 1: Vip3A protoxin; lanes 2-7: Vip3Aa10 were activated by 0.01%, 0.10%, 1.00%, 10.00%, 25.00%, 100.00% trypsin (wt/wt) at 37℃ for 1 h, respectively, followed by stopping the reaction with AEBSF at room temperature for 10min and SDS-PAGE. C-The preparation of Vip3Aa10 and activated Vip3Aa10. Lane 1: Vip3Aa10 protein; lane 2: Activated Vip3Aa10. M: low molecular weight protein marker.图1 Vip3Aa10的制备与活化Fig.1 The preparation and activation of Vip3Aa10

鳞翅目昆虫的中肠环境为中性偏碱性，Cry1A毒素在碱性条件下更容易与BBMVs结合并形成寡聚体[18]。为了分析pH对Vip3Aa10-T与BBMVs结合的影响，将Vip3Aa10-T在不同的pH条件下与BBMVs结合。Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0～10.0的条件下都能与甜菜夜蛾的BBMVs结合，但是在pH8.0时结合量最多，随着pH的升高而逐渐降低(图2B)。

为了进一步验证Vip3A与BBMVs的结合是否有物种特异性，将Vip3Aa10-T在pH8.0和10.0条件下分别与甜菜夜蛾和黄粉虫BBMVs结合。免疫印迹结果显示，活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾和黄粉虫BBMVs都能结合。而且，都是在pH8.0时的结合量高于pH10.0(图2C)。

2.4 Vip3Aa10在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白

为了检测Vip3Aa10在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白，先将甜菜夜蛾BBMVs经SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上，再依次与生物素标记的Vip3Aa10-T和辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素孵育，最后用化学发光法检测。生物素标记的Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMsV上有4条结合蛋白，其分子量分别为80、38、31和22 kDa(图3)。

注：A为Vip3Aa10蛋白与甜菜夜蛾BBMVs的结合。泳道1为甜菜夜蛾BBMVs；泳道2为Vip3Aa10前毒素；泳道3为活化后的Vip3Aa10；泳道4为活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs结合。B为不同pH条件下Vip3Aa10-T蛋白与甜菜夜蛾BBMVs的结合。泳道1为甜菜夜蛾BBMVs；泳道2为Vip3Aa10-T蛋白；泳道3-5分别为在pH 8.0、9.0和10.0条件下Vip3Aa10-T蛋白与甜菜夜蛾BBMVs结合。C为活化的Vip3Aa10蛋白与甜菜夜蛾和黄粉虫BBMVs的结合。泳道1为甜菜夜蛾BBMVs；泳道2为黄粉虫BBMVs；泳道3为Vip3Aa10-T蛋白；泳道4和6分别为Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0和10.0条件下与甜菜夜蛾BBMVs结合；泳道5和7分别为Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0和10.0条件下与黄粉虫BBMVs结合。M为低分子量蛋白marker。Note:A-The binding of Vip3Aa10 protein to S. exigua BBMVs. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: Vip3Aa10 protoxin; lane 3: activated Vip3Aa10; lane 4: activated Vip3Aa10 bound to S. exigua BBMVs. B-The binding of Vip3Aa10-T protein to S. exigua BBMVs under different pH conditions. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: Vip3Aa10-T protein; lanes 3-5: the binding of Vip3Aa10-T protein to S. exigua BBMVs at pH 8.0, 9.0 and 10.0, respectively. C-The binding of the activated Vip3Aa10 protein to S. exigua and T. molitor BBMVs. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: T. molitor BBMVs; lane 3: Vip3Aa10-T protein; lanes 4 and 6: Vip3Aa10-T proteins bound to S. exigua BBMVs at pH 8.0 and 10.0, respectively; lanes 5 and 7: Vip3Aa10-T protein bound to T. molitor BBMVs at pH 8.0 and 10.0, respectively. M: low molecular weight protein marker.图2 Vip3Aa10蛋白与甜菜夜蛾BBMV的结合Fig.2 The binding of Vip3Aa10 protein to S. exigua BBMVs

注：泳道1为甜菜夜蛾BBMVs，M为低分子量蛋白Marker。Note:Lane 1: S. exigua BBMVs, M: low molecular weight protein marker.图3 配体印迹法检测Vip3Aa10在甜菜夜蛾上的结合蛋白Fig.3 The Vip3Aa10 binding-protein on S. exigua BBMVs determined by ligand blot

3 讨 论

Vip3A毒素的杀虫过程与Cry毒素类似，都是经历昆虫摄入、被昆虫中肠内的蛋白酶活化、与昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，导致细胞死亡[2]。Vip3A可被敏感昆虫中肠汁液和胰蛋白酶活化得到的62、43、33和22 kDa的蛋白[3]。这4条带的产生是由于在上样缓冲液中62 kDa的片段被胰蛋白酶进一步降解成43和33 kDa的条带。因为在反应结束后加入上样缓冲液，缓冲液中的SDS能将Vip3A变性，而不能将胰蛋白酶失活。若用AEBSF终止反应，这种现象就会消失，只剩下62和22 kDa的条带[8]。在图1B中，除62和22 kDa的条带外，33 kDa的条带依然存在。

鳞翅目昆虫的中肠环境是中性偏碱性。随着溶液的碱性越来越强，Cry1A毒素更容易与BBMVs结合并形成寡聚体[18]。在图2B和图2C中，活化的Vip3Aa10在pH8.0时与BBMVs的结合最强。Vip3A在不同pH溶液中的形状是不同的[19]，这些现象解释为什么在pH8.0时活化的Vip3Aa10更容易在BBMVs上形成孔道[10]。此外，活化后的Vip3A能与BBMVs结合。在图2A中，Vip3Aa10前毒素比活化后的毒素更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合。因为当用2%(wt/wt)胰蛋白酶活化Vip3Aa10前毒素时，用SDS-PAGE检测时，看不到Vip3Aa10前毒素，只能看到62 kDa的活化毒素。当用免疫印迹检测时，却能看到这条带。而且，在胰蛋白酶处理后的溶液中，Vip3Aa10前毒素与Vip3Aa10-T的亮度比约1∶3，但是当与BBMVs孵育后，结合到BBMVs上的Vip3Aa10前毒素与Vip3Aa10-T的亮度比约1∶1。当用生物素标记的Vip3Aa10前毒素与BBMVs结合时，基本检测不到条带(未发表数据)。

Vip3A与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合是其发挥杀虫活性的关键。Vip3A毒素在烟草天蛾BBMV上能结合分子量分别为80 kDa和100 kDa蛋白[3]，在灰翅夜蛾BBMV上能结合分子量分别为55 kDa 和100 kDa 的蛋白[4]。Vip3Aa10在甜菜夜蛾上的结合蛋白有4条，其分子量分别为80、38、31和22 kDa。尽管在图3中，除这4条带外，还有其他的条带，但是当显色时间短时，其他的条带看不到。这说明Vip3Aa-T与这4条蛋白的结合能力是较强的，也较有可能是Vip3a的受体蛋白。这为后续鉴定Vip3A的受体奠定基础。