超微血管成像和超声造影对颈动脉粥样硬化斑块内新生血管的评估价值

李天天，王 华

(1.新乡医学院，河南 新乡 453003；2.郑州大学附属洛阳中心医院超声科，河南 洛阳 471000)

近年来，脑血管疾病死亡的人数逐年上升，且发病年龄逐步呈现年轻化趋势[1]。目前，脑血管疾病是导致患者死亡和致残的主要原因，其常见的疾病类型是颈动脉狭窄或闭塞，引起颈动脉狭窄或闭塞的发病机制主要是动脉粥样硬化[2]。研究表明，动脉粥样硬化过程中形成的新生血管可以加速斑块生长，同时也会导致不稳定斑块的形成，而不稳定斑块破裂是导致心脑血管疾病最根本的始动因素[3]。已有研究发现，斑块内新生血管生成可作为预测斑块稳定性的独立指标[4]。近年来，随着超声诊断技术的快速发展，超微血管成像(super micro-vascular imaging,SMI)和超声造影(contrast-enhanced ultrasonography,CEUS)在多种疾病的诊断和治疗中得到广泛应用，其具有操作简单、方便快捷、无创伤、可重复、效果确切等特点，受到了临床医师和患者的高度认可。本研究应用SMI和CEUS评估斑块内新生血管,并与评估斑块内新生血管的金标准微血管密度(microvessel density,MVD)相对照，探讨SMI与CEUS评估斑块内新生血管的价值，旨在筛选经济、无创、快捷筛查脑卒中高危患者的方法，以便有针对性地及早进行临床干预，预防脑血管事件的发生。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年9 月至 2019 年 5 月洛阳市中心医院因颈动脉狭窄或闭塞住院拟行颈动脉内膜剥脱术治疗患者 40 例为研究对象，其中男29例，女11例；年龄48～79(65.9±6.8)岁；无相关临床症状者 3 例，有冠状动脉粥样硬化性心脏病史 12 例，中风史 11 例，具有高血糖、高血脂、高血压、烟酒嗜好等高危因素者 30 例。纳入标准：(1)常规超声检查发现低回声及低回声为主的混合回声斑块者；(2)年龄>18岁；(3)签署颈动脉超声造影检查知情同意书。排除标准：(1)严重心脏、肝脏、肾脏功能不全者；(2)意识不清不能配合检查者；(3)存在高回声及高回声为主的混合回声斑块者；(4)超声造影剂使用禁忌证者，包括已知对六氟化硫或造影剂其他成分有过敏史者；(5)近期急性冠状动脉综合征或临床不稳定性缺血性心脏病患者，包括正渐变为或进行性心肌梗死患者；(6)过去7 d 内心脏症状出现明显恶化者；(7)刚接受冠状动脉介入手术者或存在其他提示临床不稳定的因素(如最近心电图、实验室或临床所见提示的恶化)者；(8)急性心力衰竭，心功能III/IV级及严重心律失常的患者；(9)伴有右向左分流的心脏病患者、重度肺动脉高压患者(肺动脉压>90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、未控制的高血压患者和成人呼吸窘迫综合征患者；(10)孕妇及哺乳期患者。行颈动脉内膜剥脱术的指征：(1)伴有头晕、肢体无力等临床症状的患者，颈动脉截面积狭窄率>50%；(2)无任何临床症状者，颈动脉截面积狭窄率>70%。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器CD34抗体购自洛阳传奇生物科技公司，二抗(山羊抗兔)、3，3′-二氨基联苯胺显色液(diaminobenzidine，DAB)购自丹麦丹科股份有限公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solation，PBS)购自北京三药科技开发公司，苏木精购自北京九州柏林生物科技有限公司，SonoVue造影剂购自意大利Bracco公司；东芝500 彩色多普勒超声诊断仪购自日本东芝公司，电子显微镜、切片机购自德国莱卡公司。

1.3 颈动脉斑块内新生血管SMI和 CEUS检查所有患者术前均行颈动脉斑块SMI和 CEUS超声检查，应用高频线阵探头，频率4～11 MHz,此仪器具有 SMI和 CEUS 技术软件。所有超声检查均由从事副主任医师岗位工作3 a以上者指导完成。患者取平卧位，头略偏向被检侧对侧，暴露颈部，探头横向、纵向扫查颈动脉，保持探头不动，于目标斑块处启动SMI模式，参数设置为MI=1.5，difft=8.0，G=77，DR=600。设置后取每个斑块横切面由上肩部至下肩部的图像及纵切面由顶部至基底部的图像，观察斑块内有无新生血管及评估新生血管丰富程度，存储图像。打开实时CEUS 模式，参数设置为MI=0.08，频率1.7～3.4 MHz，12帧·s-1，深度5 cm，聚焦于颈动脉水平。参数设置后保持不变。按常规配制 SonoVue造影剂(59 mg六氟化硫微泡和4.8 mL生理盐水混合后，人工剧烈震荡直至冻干粉末完全分散)。将微泡混悬液抽吸至注射器，应用20 G套管针穿刺肘正中静脉，团注1.6 mL后，尾随2～3 mL生理盐水冲管。在注射造影剂后观察颈动脉腔内造影剂显影效果。存储颈动脉腔内出现造影剂前3个心动周期及后15个心动周期的图像以供实时动态分析，观察斑块内有无新生血管,评估新生血管的丰富程度。由于SMI及CEUS 评估新生血管均为线状或点状强回声，因此采取同样的分级标准，0级：斑块内无增强；1 级：斑块内1～3 个点状增强；2级：斑块内3个以上点状和(或)1～2处短线状增强；3级：斑块内2处以上线状增强，并贯穿或大部贯穿斑块，或有流动感[5]。

1.4 免疫组织化学染色法检测颈动脉斑块中的MVD值由血管外科医生对患者实施颈动脉内膜剥脱术，首先于患侧下颌角上下位置切开胸锁乳头肌内缘，显露颈动脉，用夹子将颈总动脉、颈动脉、颈外动脉及其分支血管阻断，然后根据造影显示的狭窄范围，沿纵轴切开颈内动脉至颈总动脉的狭窄部分，用剥离子将增生狭窄的部分切掉，将颈动脉内膜剥开，恢复颈动脉的通畅性。将取下的完整斑块送病理检查，选择斑块的肩部、基底部、顶部进行多处取材，并将其切成适宜大小的组织块，使用乙醇脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片，石蜡切片脱蜡至水，体积分数3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加CD34抗体，37 ℃孵育1～2 h，PBS冲洗3次，每次 5 min，滴加生物素标记二抗(山羊抗兔)，37 ℃孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，高倍显微镜下观察，细胞质呈现棕黄色或棕褐色为CD34阳性，即血管内皮细胞。计数新生血管数量的方法：呈现CD 34阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇均计为1个血管；取血管着色最密集的3个视野(每个视野面积为0.785 mm2)，计数MVD，取均值。

2 结果

2.1 SMI、CEUS及MVD法检测颈动脉斑块内新生血管检出率比较结果见图1。40例患者中，SMI检出斑块内新生血管31例(77.5%)，CEUS检出斑块内新生血管33例(82.5%)，MVD法检出颈动脉斑块内新生血管37例(92.5%)，SMI、CEUS检测颈动脉斑块内新生血管的检出率低于MVD法，但差异无统计学意义 (χ2=3.530、1.830，P>0．05)。

2.2 SMI、CEUS评估颈动脉斑块内新生血管分级程度与MVD的相关性SMI评估新生血管行分级程度中 0、1、2、3级分别为9、10、11、10例，其MVD分别为(5.00±3.84)、(13.70±3.59)、(21.82±4.02、30.80±3.74)个·mm2；CEUS评估新生血管分级程度中0、1、2、3级分别为7、8、11、14例，其MVD分别为(5.71±5.65)、(13.00±4.44)、(18.82±4.58)、(28.64±4.88)个·mm2。不同程度SMI、CEUS分级患者的MVD均呈递增趋势，两两比较差异均有统计学意义(P<0．05)；SMI、CEUS评估新生血管分级程度与MVD呈正相关(r=0.911、0.883，P<0.01)。

A:SMI 0级斑块内无增强()；B:CEUS 0级斑块内无增强()；C：CD34 免疫组织化学染色(×200)，无新生血管；D:SMI 1级斑块内2个点状增强()；E:CEUS 1级斑块内2个点状增强()；F:CD34 免疫组织化学染色(×200)，见少量新生血管()；G:SMI 2级或3级斑块内线样贯穿增强或3个以上点状增强()；H:CEUS 2级或3级斑块内线样贯穿增强或3个以上点状增强()；I:CD34 免疫组织化学染色(×200)，见丰富新生血管()。

图1 SMI、CEUS及MVD法检测颈动脉粥样硬化斑块内新生血管

Fig.1 Detection of neovascularization in carotid atherosclerotic plaques by SMI,CEUS and MVD

3 讨论

颈动脉粥样硬化斑块是缺血性脑血管病的危险因素之一，而缺血性脑血管病的主要发病机制是血管管腔狭窄引起血流动力学改变及不稳定斑块脱落形成栓子。当前研究认为，不稳定斑块及有症状的颈动脉疾病与斑块内新生血管数量呈正相关，通过对斑块内新生血管的评估，可以初步判断斑块的稳定性[6]。新生血管的形成之所以能够使斑块变得不稳定，其原因可能是新生血管仅由血管内皮细胞组成，无平滑肌细胞，周围也无结缔组织和基底膜，故其脆性和通透性增加，易破裂出血；新生血管会释放大量的黏附因子，促使炎性细胞聚集和浸润，加重内皮细胞的损伤[7]。因此,采取有效的影像学方法及早评估颈动脉斑块的稳定性，尤其是观察斑块内是否存在新生血管，并对其进行干预，可有效减少发生心脑血管事件的风险。

目前，针对颈动脉斑块内新生血管的影像学检查方法很多，如计算机断层摄影术血管造影、磁共振成像技术、动脉造影、血管内超声、光学相干断层扫描等[8]，但这些检查方法可重复性差，价格偏贵，患者不易接受。近年来,随着超声技术迅速发展，有研究发现,CEUS在检测颈动脉斑块新生血管方面具有很高的敏感性，该检查方法不仅无创、可重复性强，便于临床推广，而且实时显像、无造影剂外溢至血管外，能够对斑块内新生血管进行直观清晰显示[9]。而SMI作为一种新型血管成像技术，可以更敏感地捕捉低速血流，能够有效对颈动脉斑块新生血管患者进行诊断[10]。有研究显示，SMI、CEUS对于斑块内部新生血管、斑块稳定性的诊断结果与金标准MVD法具有高度一致性[11]。本研究运用SMI和CEUS技术检测颈动脉斑块内新生血管，并与评估斑块内新生血管的金标准MVD相对照,结果显示，SMI、CEUS检测颈动脉斑块内新生血管的检出率与MVD法比较差异无统计学意义,而且不同SMI、CEUS分级患者的MVD均呈递增趋势，SMI、CEUS评估新生血管丰富程度与MVD呈正相关，提示SMI和CEUS可以准确检测颈动脉斑块内新生血管，而且这2种方法均可实施实时无创检查。

综上所述，利用SMI、CEUS技术能够准确评估颈动脉粥样硬化斑块内新生血管情况，为临床评估患者颈动脉斑块的稳定性、早期诊断及制订治疗方案提供更多、更准确的信息，在临床诊治中有重要的应用价值。