盐酸异丙肾上腺素腹腔注射建立心肌缺血性坏死大鼠模型的最佳药物浓度研究

王亦如,蔡新华

(1.广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科暨区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，广西 南宁 530000；2.新乡医学院基础医学院组织胚胎学教研室，河南 新乡 453003)

心肌梗死是常见的心血管疾病，是临床主要的致死因素之一[1]。心肌缺血性坏死动物模型广泛应用于心血管疾病发病机制和药物干预研究，针对不同研究目的，适用的动物模型也有差异,制备有效的动物模型是完成实验的前提。盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline hydrochloride，ISO)注射是制备心肌缺血性坏死动物模型的简易方法[2-3]，但目前该方法的药物使用剂量差别较大[4]。心电图检查、心肌标志物检测与免疫组织化学法检测是判断心肌缺血性坏死动物模型心肌缺血坏死损伤程度的常用方法[5]。心肌缺血性坏死的特征性心电图改变是出现ST段抬高、T波异常以及病理性Q波。心肌标志物检测对明确心肌缺血性坏死有重要的辅助作用，肌酸激酶(creating kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creating kinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)是常用的血清心肌标志物，与心肌缺血性坏死进展及预后有明显关系[5]。对心肌缺血性坏死模型的心肌组织进行形态学观察可以直观观测心肌坏死面积[6]。本研究采用不同剂量ISO对Sprague Dawley(SD)大鼠进行腹腔注射，通过观察各组大鼠心电图改变、血清心肌标志物和心肌缺血性坏死程度的差异，评估不同剂量ISO制备心肌缺血性坏死动物模型的效果，为心肌梗死动物模型的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性清洁级成年SD大鼠42只，体质量140～180 g，新乡医学院实验动物中心提供，标准饲料和清洁饮用水饲养于湿度恒定、22～26 ℃、安静、无强光直射、昼夜交替的室内环境。

1.2 主要试剂与仪器ISO注射液购自上海禾丰制药有限公司(国药准字431021344)；心肌酶谱生生物化学化试剂浙江康特生物有限公司；BH8显微摄像系统日本Olympus公司，Beckman DXC800数字成像系统美国贝克曼库尔特公司。

1.3 动物模型制备适应性饲养3 d后，将大鼠随机分为对照组和2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组，每组7只。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠分别按照2、4、6、8、10 mg·kg-1将ISO溶于生理盐水，配成10 mL工作液进行腹腔注射，每日1次，连续7 d；对照组大鼠给予等体积生理盐水腹腔注射，每日1次，连续7 d。每日注射15 min后及第8天麻醉大病稳定后监测大鼠心电图，观察大鼠心率、ST段基线偏移高度、T波改变及有无病理性Q波出现，以判断大鼠对ISO的药物反应和心肌缺血性坏死模型的制备情况。

1.4 各组大鼠血清心肌酶检测各组大鼠均于连续7 d腹腔注射结束后的第2天，给予100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔麻醉，待大鼠稳定后记录心电图，然后胸骨正中位快速开胸，打开心包膜，暴露心脏，用注射器抽取心室血置于 EP管中，室温静置2 h，3 000 r·min-1离心20 min,收集血清,用心肌酶谱生物化学试剂进行心肌酶谱学检查，检测指标包括CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-羟丁酸脱氢酶(ɑ-hydroxybutyrate dehydrogenase，ɑ-HBDH)，以辅助判断大鼠心肌缺血性坏死的程度。

1.5 各组大鼠心肌组织学观察各组大鼠采血结束后取出心脏，取左心室组织，修剪后水平定位、包埋剂包埋，液氮快速冷冻，移入冰冻切片机内，复温至与冷冻箱温度一致后进行层厚8 μm切片，组织块修理到暴露心腔开始收集切片，自然干燥，冷丙酮固定15 min，苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色，中性树胶封片，显微镜下采集图片，每张切片采集6～10张，利用Photoshop7.0.1软件进行图片拼接，每例心肌缺血性坏死模型拼接6张完整心室组织横断面图片；利用Image J图像分析软件分析心肌缺血坏死区面积百分比，心肌缺血坏死区面积百分比=心肌缺血坏死区面积/心室横断面面积×100%。

2 结果

2.1 6组大鼠心电图表现结果见图1。ISO腹腔注射第7天，对照组大鼠心电图表现正常(图1A)；2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心电图均可见ST段基线偏移向上抬高、P波与R波间期明显、T波量小于R波及形成高大的近似“帐篷样”单波等心肌缺血性改变(图1B～图1E)。其中，ISO 4 mg·kg-1组大鼠心率增快，其心电图ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出现(图1C)。对照组及2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心率分别为(394.0±7.5)、(403.4±30.2)、(425.6±16.4)、(389.8±13.9)、(390.7±27.5)、(391.5±22.4)次·min-1，2、4 mg·kg-1ISO组大鼠心率高于对照组，8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心率低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；6 mg·kg-1ISO组大鼠心率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：对照组；B：2 mg·kg-1ISO组；C：4 mg·kg-1ISO组；D：6 mg·kg-1ISO组；E：8 mg·kg-1ISO组；F：10 mg·kg-1ISO组。

图1 ISO诱导第7天大鼠心电图表现

Fig.1 ECG of rats induced by isoproterenol for seven days

2.2 6组大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH水平比较结果见表1。与对照组比较，4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH显著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK、CK-MB显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与2 mg·kg-1ISO组比较，4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清AST、CK、CK-MB显著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清LDH显著升高，8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清ɑ-HBDH显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与4 mg·kg-1ISO组比较，6、8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK显著升高，8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK-MB显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与6 mg·kg-1ISO组比较，10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK显著降低，8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK-MB显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与8 mg·kg-1ISO组比较，10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK、CK-MB显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 6组大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH的表达水平

Tab.1 Comparison of the levels of serum CK,CK-MB,LDH,AST and ɑ-HBDH of rats among the six groups

组别nAST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)CK/(U·L-1) CK-MB/(U·L-1) ɑ-HBDH/(U·L-1)对照组7766.3±294.5712.5±199.61 133.2±427.4 313.6±110.3 275.9±102.62 mg·kg-1ISO组 7788.5±275.1788.8±275.5 1 485.3±465.1a370.5±98.4a332.6±95.44 mg·kg-1ISO组 71 642.7±522.6ab1 560.3±513.3a4 370.5±731.5ab1 560.3±475.6ab703.2±180.3a6 mg·kg-1ISO 组71 870.9±589.2ab1 769.1±589.4ab5 427.6±1 026.2abc2 228.1±480.0ab 788.3±133.7a8 mg·kg-1ISO组72 117.4±665.3ab 2 123.4±570.2ab5 430.2±997.8abc3 095.4±130.2abcd1 014.7±195.9ab10 mg·kg-1ISO组71 870.1±503.4ab 1 693.5±522.5ab 4 589.4±1 235.3abde1 769.5±408.3abe817.1±199.1ab

注：与对照组比较aP<0.05；与2 mg·kg-1ISO组比较bP<0.05；与4 mg·kg-1ISO组比较cP<0.05；；与6 mg·kg-1ISO组比较dP<0.05；与8 mg·kg-1ISO组比较eP<0.05。

2.3 不同剂量ISO组大鼠心肌组织病理学表现结果见图2。不同剂量ISO组大鼠均出现心室肌细胞缺血坏死，坏死区主要集中在近心内膜的心肌层，表现为坏死心肌细胞溶解消失，大量成纤维细胞迁移至坏死区，坏死区可呈局灶状或连接成片；非坏死区肌细胞间隙增大，肌丝紊乱。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心肌缺血坏死区面积百分比分别为(2.54±0.09)%、(11.42±2.15)%、(7.58±1.47)%、(11.43±1.36)%、(9.00±2.24)%。4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心肌缺血坏死区面积大于 2 mg·kg-1ISO组，差异有统计学意义(P<0.05)；其余组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A：对照组；B：2 mg·kg-1ISO组；C：4 mg·kg-1ISO组；D：6 mg·kg-1ISO组；E：8 mg·kg-1ISO组；F：10 mg·kg-1ISO组。“△”示缺血坏死区。

图2 ISO诱导大鼠心肌缺血性坏死病理学表现(HE染色，×40)

Fig.2 Pathological manifestation of myocardial ischemic necrosis induced by isoproterenol in rats (HE staining，×40)

3 讨论

目前，制备心肌缺血性坏死动物模型的方法有多种，常用的有结扎、夹闭冠状动脉使之狭窄或阻塞导致的心肌缺血性坏死，以及注射ISO、垂体后叶素、多柔比星等药物制备心肌缺血性坏死模型等[3,7]；不同的制备方法均有相应的优缺点，结扎、夹闭冠状动脉等开胸手术方法制备的模型虽可最大限度模拟临床上的急性心肌缺血，但受术中麻醉剂量、创口大小等因素影响，不同模型之间的效果差异很大；药物干预法较开胸手术方法操作更为简单、有效，常用于心肌缺血性坏死模型的制备。ISO作用于心脏β1受体，扩张冠状动脉血管，增加心肌收缩力和收缩频率，增加心肌细胞耗氧量，会导致心肌细胞相对缺氧，引起心肌细胞坏死，因此，ISO是常用的制备心肌缺血性坏死动物模型的试剂，其具有操作简单、动物死亡率低的优点，但制备模型时使用剂量存在较大差异[8-11]。以往研究发现，低剂量ISO可以诱导以心肌纤维化和坏死为特征的动物模型[12]。因此，本研究在预试验基础上，观察腹腔注射不同剂量ISO对大鼠心肌缺血性坏死的影响，旨在寻找制备大鼠心肌缺血性坏死模型的最佳剂量。

ISO可以增快心率，增强心肌收缩力，从而使心肌耗氧量增加，进而导致心肌供给血氧失衡，最终导致心肌缺血性坏死的发生[13]。本研究结果显示，ISO作用于大鼠后，各给药组大鼠心率总体随药物浓度增大呈先增快后减慢趋势，其中2、4 mg·kg-1ISO组大鼠心率高于对照组，8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心率低于对照组，6 mg·kg-1ISO组大鼠心率与对照组比较差异无统计学意义；各给药组大鼠心电图均可见ST段基线偏移向上抬高、P波与R波间期明显、T波量小于R波及形成高大的近似“帐篷样”单波等心肌缺血性改变，提示大鼠心肌缺血性坏死模型构建成功；而4 mg·kg-1ISO组大鼠心率增快，且其心电图ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出现；以上结果提示，4 mg·kg-1ISO对大鼠心率、心电图改变的影响最大。临床上，检测心肌标志物对于明确心肌缺血性坏死有重要的辅助作用，高东雁等[14]研究显示，ISO诱导后大鼠血清CK和LDH均会显著升高。 CK、CK-MB、LDH、AST是常用的血清心肌标志物，当心肌受损时，心肌组织中CK、CK-MB、LDH、AST由于心肌细胞坏死释放入血，血清心肌酶水平呈现不同程度升高，对判断心肌损伤程度有重要辅助价值。本研究结果显示，在ISO诱导后，与对照组比较，4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH显著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK、CK-MB显著升高；与2 mg·kg-1ISO组比较，4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清AST、CK、CK-MB显著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清LDH显著升高，8、10 mg·kg-1ISO组大鼠血清ɑ-HBDH显著升高；与4 mg·kg-1ISO组比较，6、8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK显著升高，8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK-MB显著升高；与6 mg·kg-1ISO组比较，10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK显著降低，8 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK-MB显著升高；与8 mg·kg-1ISO组比较，10 mg·kg-1ISO组大鼠血清CK、CK-MB显著降低。观察已制备的心肌缺血性坏死模型大鼠心肌组织的形态学，可以直观观测心肌组织坏死的面积。本研究结果显示，不同剂量ISO组大鼠均出现心室肌细胞坏死，4、6、8、10 mg·kg-1ISO组大鼠心肌缺血坏死区面积均大于2 mg·kg-1ISO组，其余组间两两比较差异无统计学意义，但4 mg·kg-1ISO组大鼠心电图呈现典型的缺血性坏死表现，且诱导剂量更低。

综上所述，不同剂量ISO腹腔注射均可造成大鼠心肌缺血性坏死损伤，但结合对心电图、血清心肌酶谱变化及心肌缺血坏死面积的影响，4 mg·kg-1ISO腹腔连续注射制备大鼠心肌缺血性坏死大鼠模型的效果最佳。