大孔树脂分离纯化枸杞多糖的研究

2019-02-21，，，

山东化工 2019年2期

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(南京科技职业学院生物与环境学院，江苏南京 210048)

枸杞是一种传统的滋补中药，我国很多地方都种植枸杞。枸杞自身拥有丰富的氨基酸、类胡萝卜素、微量元素，以及富有药效功能的多糖和黄酮成分，其中枸杞多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤，提高免疫力等作用[1-2]。Mao[3]等人发现枸杞对癌细胞的扩散具有抑制作用，王柏昆[4]等通过实验证明10mg/kg枸杞多糖(LBP)对荷瘤小鼠抑瘤率达31%。因此枸杞的成分和药理研究也成为人们研究的热点之一。

为了提高枸杞多糖的产品纯度和附加值，近年来，凝胶过滤层析已被较多应用于多糖的分离中。郭琦[5]采用水提醇沉法得到枸杞多糖，再经Sephadex G-150 凝胶色谱柱纯化得 LBP3-I，环境扫描电镜显示LBP3-I 呈现高分支结构，主要呈链状，且糖链间多相互缠绕聚集成环状。大孔吸附树脂也越来越多的被用到枸杞多糖的分离纯化工作中，肖珊[6]考察了五种不同型号的大孔吸附树脂对枸杞多糖的吸附纯化效果，得到HPD300树脂对枸杞多糖的除杂效果最好，除杂率高达 82.35%，多糖的保留率为69.66%。鲁晓丽[7]考察了9种大孔吸附树脂脱除枸杞多糖提取液中色素脱除的能力，在最佳工作条件下选择的D318树脂的多糖保留率、脱色率和蛋白清除率分别为85.49%、67.32%和58.76%。

本文以枸杞为原材料，利用热水浸提法得到粗枸杞多糖提取溶液后，在前期工作的基础上，采用大孔吸附树脂对枸杞多糖进一步分离纯化，并进一步探索大孔吸附树脂的吸附动力学和热力学机制，为枸杞的深提取加工提供理论基础。

1 实验原材料

枸杞：购买于当地上海华联超市，产自宁夏，经热水浸提温度90℃；料水比1∶35(W∶V)，提取时间2 h后得到粗提取液。

大孔吸附树脂：市售的5种大孔吸附树脂具体物性参数见表1。

表1 不同大孔吸附树脂的特性参数

2 实验部分

2.1 实验设备和仪器

实验所用仪器和设备如表2所示。

表2 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 大孔吸附树脂预处理

准确称取市售50 g的大孔吸附树脂和100 mL酒精放入250 mL锥形瓶中，浸泡4h，并不时搅动，使树脂充分溶胀。然后用5～8倍的乙醇冲洗至流出液加水稀释不变混。乙醇处理后，再用去离子水清洗其中乙醇，直至将乙醇完全置换出来即可使用。

2.2.2 树脂吸附量测定

将市售的5种大孔吸附树脂，经预处理后，取湿树脂1.0 g于50mL小三角瓶中，取枸杞粗提取液30mL，浓度为15g/L,于恒温摇床中以150 rpm转速于295k恒温震荡8h，每隔1h取上清液分析其中枸杞多糖的浓度，计算平衡吸附量qe=(mg/g)。qe=(C0-Ce)V/G,其中，式中C0和Ce分别为起始溶液和平衡溶液枸杞多糖的浓度(mg/mL),V为溶液体积(L),G为树脂质量(g)。

2.2.3 枸杞多糖吸附的动力学曲线拟合

称取1.0g树脂，放入250mL锥形瓶中，分别加入配制好的含枸杞多糖5，10，15，20，30g/L的粗溶液25mL，在一定的温度下150r/min吸附8 h，测定不同初始浓度下吸附达到平衡后枸杞多糖的吸附量。

2.2.4 紫外扫描分析

采用UV-1800型紫外分光光度计(岛津企业管理中国有限公司)分析枸杞多糖的特征吸收峰，扫描范围190～500nm，光径1cm。

2.2.5 红外扫描分析

使用傅立叶变换红外光谱仪(VERTEX 80，德国Bruker)分析枸杞多糖的化学结构特征。扫描范围4000～400 cm-1，分辨率为2.0 cm-1。得到的FTIR谱图使用Origin 8.0科学作图软件处理。

2.2.6 树脂再生

准确称取经过预处理的湿树脂1.0 g置于50 mL锥形瓶中，取20 mL初始浓度为25 g/L的粗枸杞多糖提取液，于恒温摇床中以150 r/min的转速于295 k恒温震荡8 h后，取上清液分析其中枸杞多糖的浓度。实验结束，将多余料液丢弃，将树脂用蒸馏水反复洗涤后沥干，用90%乙醇浸泡树脂，用量约为100 mL，于恒温摇床中以150 rpm的转速于295 k恒温震荡1 h。用水冲洗至pH为7.0左右，可进行下一轮重复操作。

3 结果与讨论

3.1 枸杞多糖的紫外分析

将浸提得到的枸杞多糖在紫外190～500nm处进行紫外扫描，所得图谱如图1所示。

由图1可以看出，在紫外200nm处为多糖的特征吸收峰，同时在紫外263nm处有一个特征吸收峰，推测其为核酸的吸收峰，表明提取的提取枸杞液中仍含有其他杂志，需要进一步分离纯化。

图1 枸杞多糖的紫外扫描图谱

3.2 枸杞多糖的大孔吸附树脂的筛选

实验树脂经预处理后，称取湿树脂1.0g于50 mL小锥形瓶，加入野生枸杞粗提取液30mL，枸杞多糖初始浓度为15 g/L，在恒温摇床中以150 rpm的转速于295k恒温震荡8 h，取上清液测定枸杞多糖浓度，计算树脂的平衡吸附量qe=(mg/g)，结果如图2所示。

图2 不同吸附树脂对枸杞多糖的吸附容量对比

从图2可以看出，经摇床震荡吸附达到平衡后，树脂HPD300对枸杞多糖的平衡吸附量最大，为210.3mg/g。其次是DM301树脂，吸附量可达190.8mg/g。因此，后续实验选用HPD300树脂对枸杞多糖对枸杞多糖进行分离纯化。

3.3 枸杞多糖的大孔吸附树脂吸附动力学曲线

称取湿树脂1.0g于50mL小三角瓶中，加入枸杞多糖提取液30mL，初始枸杞多糖浓度调节为15 g/L，于恒温摇床中以150 rpm，295k条件下恒温震荡8 h，每隔1h取上清液，分析上清液中枸杞多糖浓度，绘制吸附动力学曲线，结果如图3所示。

为了考察枸杞多糖在HPD300树脂上的吸附平衡时间，采用静态摇床吸附实验，测定HPD300树脂对初始质量浓度为25 g/L 的枸杞多糖的吸附动力学曲线，图3可以看出，枸杞多糖在HPD300树脂上的吸附量随时间的推移，先是明显增大，当吸附进行到180 min 时，吸附速率达到平衡，吸附量不再发生明显变化，因此，树脂 HPD300合适的吸附时间为180 min。其后采用90%乙醇对吸附在树脂上的枸杞多糖进行解析，解析率可达90.9%。

图3 枸杞多糖吸附动力学曲线

3.4 枸杞多糖吸附等温曲线

称取湿树脂HPD300 1.0g于50mL小三角瓶中，加入粗枸杞多糖提取液30 mL，枸杞多糖初始浓度为15 g/L，于恒温摇床中以150 rpm，295k条件下恒温震荡8 h，每隔1 h取上清液测定其中枸杞多糖浓度，结果如图4所示。

图4 枸杞多糖吸附Freundlich曲线

吸附等温线描述大孔树脂对枸杞多糖的吸附能力，对吸附行为的理论分析和热力学计算有重要意义。以Langmuir吸附等温方程拟合，结果可知：R2=0.98563。由图4和表3可知，以Freundlich吸附等温方程拟合，结果可知：R2=0.99702。由此对比可以看出，Freundlich吸附等温方程拟合的相关系数R2值更加接近于1，因此表明树脂对枸杞多糖的吸附更好的吻合Freundlich方程。在295 K吸附温度下，树脂的平衡吸附量qe约为343.71 mg/g，可见HPD300树脂对枸杞多糖具有较高的平衡吸附量。

表3 HPD300吸附枸杞多糖Freundlich等温方程

3.5 大孔吸附树脂HPD300的再生

将经过热水浸提之后的枸杞多糖的粗提取液，配置成初始枸杞浓度45 g/L溶液，固定床层析柱每轮上样量15mL，每一轮吸附分离完之后，HPD300树脂用90%酒清洗树脂4个柱体积，去离子水冲洗大孔树脂直至pH值为中性，重新上样，进行下一轮操作，计算树脂的工作再生率和多糖回收率，如表4所示。

表4 HPD300树脂工作再生率

由表4可知，大孔吸附树脂HPD300吸附分离工艺可以重复利用，树脂经过分离纯化五轮后，其再生效率可达85.09%，多糖回收率87.47%。树脂的重复使用性能较好。

3.6 枸杞多糖的红外吸收扫描

为了进一步研究树脂提纯后的枸杞多糖的特征结构，将大孔吸附树脂解析得到的枸杞多糖进行红外光谱分析，所得结果如图5 所示。

图5 枸杞多糖的红外扫描光谱

由图5可知，波长3385cm-1处的宽峰是由于 O-H 键伸缩振动峰引起的，表明多糖中存在分子内和分子间的氢键；1030cm-1内出现的强吸收峰是羧基的C-O对称伸缩振动所引起的，这表明该糖组分都含有羧基基团；636 cm-1吸收峰为吡喃糖 β 型 C-H 变角振动的特征吸收峰，表明其组成单糖为β-吡喃糖，表明提纯所得枸杞多糖均主要以吡喃糖构成[8]。