功能化阿霉素脂质体制备与肿瘤靶向性评价

宋振国，吴小瑜，程沁园，陈 慧，龙苗苗

（无锡卫生高等职业技术学校药学系，江苏 无锡 214028）

阿霉素（DOX）为广谱抗肿瘤药物，可通过嵌入DNA阻断核酸分子的合成，但会对机体正常细胞产生广泛的生物化学效应，从而对人体正常组织产生强烈的毒副作用[1]。脂质体(LP)为具有类细胞膜的双分子层脂质膜结构的微小囊泡，具有自行密合的特性，可包载疏水性或／和亲水性药物。脂质体具有的纳米尺寸可通过高渗透滞留效应（EPR）被动靶向到肿瘤部位，将脂质体作为阿霉素药物递送载体，可提高肿瘤部位药物浓度，降低药物的毒副作用[2-5]。目前已有多种阿霉素脂质体上市，但仅依靠EPR，普通阿霉素脂质体无法主动靶向肿瘤细胞，故研发功能化脂质体尤为重要。透明质酸（HA）为线性多糖，具有生物相容性好和生物可降解性等优点。HA可与肿瘤细胞表面过量表达的CD44受体结合，具有靶向肿瘤细胞的功能。故可作为药物载体用于靶向传递药物，增加药物在肿瘤部位的蓄积，有效抑制肿瘤细胞生长[6-7]。此外，与磷脂相比，多糖聚合物在体内降解较缓慢，将其修饰于脂质体表面，可提高脂质体的稳定性，增加其在体内的循环时间[8-9]。硬脂胺为亲脂性阳离子化合物，通过加入少量硬脂胺调节脂质体表面电荷，可提高其稳定性，而且用于制备的阳离子脂质体具有肺部癌症靶向治疗作用[10]。本研究中通过引入HA-硬脂胺聚合物（HS），制备功能化阿霉素脂质体，并对其体外性质和抗肿瘤活性进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DF-101S型恒温加热磁力搅拌器（郑州科泰实验设备有限公司）；RV10BS96型旋转蒸发仪（德国IKA仪器设备有限公司）；UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（日本Jeol公司）；Zetasizer Nano ZS型纳米粒度分析仪（英国Malven公司）；JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DMIL LED型倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司）。

1.2 试药

盐酸阿霉素（大连美仑生物技术有限公司，批号为J0614A，纯度＞98%）；HA（华熙福瑞达生物医药有限公司，批号为1409191，相对分子质量为5 300）；大豆磷脂（上海太伟有限公司，纯度98%）；硬脂胺（阿拉丁试剂有限公司）；胆固醇（上海生工生物工程股份有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）均购自上海晶纯生化科技股份有限公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HS 的合成

将 HA（含 0.25 mmol羧基）100 mg溶于 10 mL 无水甲酰胺中，加入等浓度比的 EDC和 NHS（60 mg）活化。称取硬脂胺72 mg，溶于 N，N-二甲基甲酰胺，然后缓慢滴加入上述溶液中，氮气保护下反应48 h。反应结束后用蒸馏水透析（截留相对分子质量为3.5×103）3 d，冷冻干燥得HS。通过1H-NMR确证聚合物化学结构。结果见图1。表明硬脂胺已成功链接到HA主链上。

图1 HS的核磁共振氢谱

2.2 功能化阿霉素脂质体的制备与表征

制备：称取磷脂500 mg和胆固醇50 mg，溶于无水乙醚，逐滴加入盐酸阿霉素溶液2 mg，旋转蒸发除尽有机溶剂，加入磷酸盐缓冲液(PBS)10 mL，水化30 min后冰浴超声10 min，然后加入HS溶液，50℃恒温孵育1 h，得功能化阿霉素脂质体（DOX／LP／HS）。同法制备阿霉素普通脂质体（DOX ／LP）。

粒径及Zeta电位测定：取适量脂质体溶液置测量杯内，采用动态光散射技术（DLS）测定脂质体的粒径、多分散系数（PDI）和 Zeta电位。DOX／LP的粒径为（47.17 ±0.85）nm，PDI为 0.297 ±0.08；经 HS 聚合物修饰后，DOX ／LP ／HS 粒径变化不大，为（51.97±0.95）nm，PDI为 0.286 ±0.07，分布较好（图 2 A）。DOX ／LP 的Zeta 电 位 为 （-4.64±0.81）mV，经 HS 修 饰 后 ，DOX ／LP ／HS 的电位降低到（-9.48±0.55）mV，这是由于HA结构中存在大量羧基所致。表面的负电有利于防止脂质体聚沉，避免血浆蛋白吸附，提高在血液中的稳定性。

透射电镜观察：通过透射电镜（TEM）观察脂质体形貌特征及粒径分布。取脂质体分散液滴于铜网上，晾干后滴加磷钨酸对其负染，室温干燥后用TEM进行观察。透射电镜图可以看出DOX／LP／HS形貌呈球形或类球形，分布较窄（图2 B）。说明脂质体具有较好的粒径及分布，适宜作为抗肿瘤药物载体。

图2 DOX／LP／HS粒径分布图及透射电镜图

包封率测定：准确量取定量DOX／LP／HS，加入甲醇10 mL超声破坏后，在480 nm波长处测定吸光度，计算药物总含量。取2.2的“制备”项下脂质体2.0 mL，置截留相对分子质量为3 000的超滤杯中，10 000 r／min离心50 min，测得游离药物含量，并计算包封率（EE）。结果，DOX ／LP 包封率为（94.8 ± 1.95）%，DOX ／LP ／HS包封率为（98.34±1.02）%，表明两种脂质体对药物均有较好的包载能力。HS插入脂质体双分子结构中，可使载药空间增大，一定程度上提高了脂质体对药物的包封率。

2.3 体外药物释放

采用动态透析法测定体外释放行为。向透析袋中加入脂质体 2 mL，将透析袋置 PBS（pH ＝7.4，0.01 mmol／L）溶液 10 mL，在 100 r／min，（37 ±0.5）℃的摇床震荡，分别于不同时间取样1 mL，并加入新鲜PBS 1 mL。于480 nm波长处测定吸光度，并计算含量及累积释放度。DOX／LP和DOX／LP／HS的体外释放行为见图3。2种脂质体在10 h内的药物释放低于20%，表明DOX几乎全部包载于脂质体中，无明显突释现象。随着时间的延长，脂质体内药物缓慢释放，具有明显缓释作用。48 h时，DOX／LP／HS的累积释放度低于DOX／LP，这可能是由于HS的疏水段硬脂烷链插入脂质体双分子层膜，导致疏水作用力增强，结构更紧密，不利于药物向外自由扩散。

图3 DOX／LP和 DOX／LP／HS体外释放行为

2.4 稳定性考察

将装有脂质体混悬液的 10 mL棕色瓶置（4±0.5）℃冰箱中，不同时间用马尔文粒径仪测量脂质体粒径，考察其稳定性。此外，将制备的脂质体混悬液置（4±0.5）℃冰箱中，不同时间取样测定包封率，然后计算6 d后脂质体泄漏率[泄漏率＝(第1天包封率-第6天包封率)／第 1天包封率 ×100%]。DOX／LP和 DOX／LP／HS放置的粒径变化见图4。可见，随着放置时间的延长，脂质体粒径均有所增加。其中第8天时，DOX／LP粒径急剧变大，并出现多峰，而DOX／LP／HS粒径变化不大，说明经HA修饰后，脂质体的稳定性有所提高。

图4 DOX／LP和 DOX／LP／HS的粒径变化

DOX／LP和 DOX／LP／HS放置 6 d后的泄漏率分别为（4.94 ±0.5）% 和（1.93 ± 0.05）% ，DOX ／LP ／HS明显低于DOX／LP，说明脂质体经HS修饰后提高了脂质体结构的致密性，使药物不易泄露，提高了脂质体稳定性。

2.5 肿瘤靶向性评价

流式细胞仪测定：将MCF-7和COS7细胞按照3×105个／孔的密度加到6孔板培养 24 h，加入2 mL游离 DOX，DOX ／LP，DOX ／LP ／HS（阿霉素终质量浓度为 5 μg ／mL）孵育 1，2，4 h(以细胞培养液为空白对照)，胰酶消化后，收集细胞，加入PBS 500 μL分散细胞后，用流式细胞仪测定相对荧光强度，代表摄取水平，结果见图5。可见，2种细胞对脂质体的摄取均有明显的时间依赖性。由于COS7细胞表面缺乏CD44受体的表达，DOX／LP／HS和DOX／LP在各个时间点的摄取无明显差异。而DOX／LP／HS在MCF-7细胞内的摄取率明显高于DOX／LP，这是因为HS修饰的阿霉素脂质体可通过细胞表面的CD44受体介导进入细胞，增加细胞内的药物蓄积量，具有更好的抗肿瘤作用。

图5 不同制剂在细胞中的摄取率

荧光显微镜观察：为了验证CD44受体介导的靶向作用，采用倒置荧光显微镜进一步观察 DOX／LP和DOX／LP／HS在MCF-7细胞内的摄取及分布情况。细胞以1.0×104个／孔的密度进行接种，孵育24 h。弃去原培养基，用PBS清洗3次，加入500 μL含游离DOX，DOX ／LP，DOX ／LP ／HS（DOX 的终质量浓度为 5 μg／mL）孵育1，2，4 h。然后PBS润洗 3次，加入 4%多聚甲醛固定 20 min，Hoechst溶液（10 μg ／mL）染色 20 min，PBS 清洗后在荧光显微镜下观察、拍照。

由图6可见，随着时间的延长，药物进入细胞的量逐渐增多，部分药物进入细胞核中，表现出时间依赖性。孵育时间为4 h时，游离DOX通过快速扩散入胞最多，且均进入细胞核内。与 DOX／LP相比，DOX／LP／HS的荧光强度明显增强，且主要集中于细胞核内，表明DOX／LP／HS具有更好的肿瘤细胞靶向性。以上结果表明，DOX／LP／HS能与肿瘤细胞表面的 CD44受体结合，提高药物的摄取量，更有效地发挥抗肿瘤作用。

图6 不同制剂在MCF-7细胞中的摄取荧光图（×40）

3 讨论

脂质体主要由磷脂和胆固醇形成类似细胞膜的双分子层结构，具有与细胞膜融合性好和生物相容性佳等特点，且可包载亲水性和亲脂性药物，故被广泛用于抗肿瘤药物的传递载体。DOX是临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，但其具有严重的心脏毒性等毒副作用，临床应用受限。目前上市的DOX／LP／HS能降低药物的心脏毒性，但稳定性差，药物易渗漏，易受RES影响，虽然经聚乙二醇修饰可提高脂质体表面的亲水性，阻止血浆蛋白吸附，减少吞噬吸收，但其仅依靠EPR被动靶向到肿瘤部位，无法进一步提高肿瘤部位的药物蓄积。通过配体对脂质体表面进行修饰是提高其靶向性的有效手段。多糖聚合物可提高疏水性药物的水溶性，易于对结构进行修饰，连接各类配体，因而在抗肿瘤靶向给药系统备受关注[11-13]。HA可与大部分肿瘤细胞过表达的CD44受体结合，通过靶向介导更多药物进入肿瘤细胞，抑制肿瘤生长[7，14]。

本研究中主要合成HS，修饰脂质体，提高脂质体的靶向性和稳定性。通过考察HS的修饰方法发现，后插入法HS可以自发嵌入脂质体结构中，得到粒径更均一的脂质体。且 DOX／LP／HS的稳定性优于 DOX／LP。硬脂胺等阳离子化合物可通过调节脂质体表面电荷提高其稳定性[8]。此外，通过体外释放等试验结构推测，HS的疏水段插入脂质体双分子层膜，导致疏水作用力增强，结构更紧密，降低了脂质体的泄漏率。DOX／LP／HS可与MCF-7细胞表面的CD44受体结合，具有更高的摄取量和细胞内蓄积率。

综上所述，本研究为构建功能化脂质体作为抗肿瘤药物载体提供了参考。但本研究中仅对HS修饰的功能化脂质体的制备及物理性质进行了研究，后续试验应深入考察其体内外抗肿瘤活性。