十味木香散质量标准研究

高永民，秦启亮，胡耀嘉

（1.青海省西宁市第一人民医院药品调配站，青海 西宁 810000； 2.青海省黄南藏族自治州食品药品检验检测中心，青海 黄南 811399； 3.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000）

十味木香散为藏族经验方，收载于六省区《藏药标准》，由木香、余甘子、荜茇、豆蔻、马尿泡、塞北紫堇、酸藤果、石榴子、人工牛黄、诃子10味药材组方[1]，有驱虫、止痛功效，是藏医用于治疗“年”及虫引起的急性腹痛常用药，使用历史悠久，疗效确切。目前的质量标准中仅有性状和制剂通则中规定的检查项，无制剂质量标准项。为了更全面控制其的内在质量，故本试验中采用薄层色谱（TLC）法对木香、马尿泡和人工牛黄等药味进行鉴别，同时采用高效液相色谱（HPLC）法测定该制剂中木香的有效成分木香烃内酯及去氢木香内酯含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Inertsil C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；BSA323S型电子天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；KQ-600型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TGL16MB型高速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；ZF-6型三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

木香对照药材（批号为 120921-201309）、去氢木香内酯（批号为111525-201209）、硫酸阿托品（批号为100040-201011）、氢溴酸东莨菪碱（批号为 100049-200308）、胆酸（批号为 110775-201105）、猪去氧胆酸（批号为110749-201316），均购自中国食品药品检定研究院；收集的5批次十味木香散样品均为黄南藏族自治州藏医院制剂室提供（批号分别为20140301，20140501，20140901，20150301，20150401）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

木香[2-3]：取样品粉末 2 g，加乙醚 30 mL，超声(功率200 W，频率 40 kHz，下同)处理15 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液；另取木香对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取去氢木香内酯对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液；按处方比例去除木香药材，并按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照TLC法（2015年版《中国药典（四部）》通则 0502，以下简称“通则 0502”）试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮（10∶3，V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液及对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

马尿泡[4]：取样品粉末10 g，加氨水5 mL润湿，用氯仿50 mL超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；取硫酸阿托品对照品、氢溴酸东莨菪碱对照品，分别加甲醇，制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；按处方比例去除马尿泡，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照TLC法(通则0502)试验，吸取4种溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨水（15∶6∶1，V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。详见图 2。

图1 木香薄层色谱图

图2 马尿泡薄层色谱图

图3 人工牛黄薄层色谱图

人工牛黄[5-6]：取样品粉末1 g，加乙醇10 mL，振摇15 min，离心，取上清液，作为供试品溶液；另取胆酸、猪去氧胆酸对照品，加乙醇，制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液；按处方比例去除人工牛黄，并按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。照TLC法（通则0502）试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（16 ∶4∶0.5∶1，V／V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图3。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验[7-9]

色谱柱：Inertsil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水（58 ∶42，V／V）；检测波长：225 nm；柱温：30℃。理论板数按木香烃内酯峰、去氢木香烃内酯峰计均应不低于3 000，分离度大于1.5，拖尾因子大于0.99。对照品溶液出峰位置上无干扰峰出现，表明阴性对照无干扰。色谱图见图4。

2.2.2 溶液制备

称取木香烃内酯对照品8.14 mg、去氢木香内酯对照品 10.87 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得木香烃内酯、去氢木香内酯质量浓度分别为 0.325 6 g／L 和 0.434 8 mg／mL 的混合对照品贮备液；精密量取上述混合对照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得木香烃内酯、去氢木香内酯质量浓度分别为 0.065 1 g／L和0.087 0 g／L的混合对照品溶液。取样品粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照处方组成及比例，取除木香外的其余药味，按制备工艺要求制成不含木香的制剂，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液 1，2，4，8，16，20 μL，按 2.2.1 项下色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程，木香烃内酯为 Y1＝1 266.22 X1-3.829，r＝0.999 6（n＝6）；去氢木香烃内酯为 Y2＝1 321.22 X2-6.711，r＝ 0.999 4（n ＝6）。结果表明，木香烃内酯、去氢木香烃内酯进样量分别在0.065 1～1.030 2 μg和 0.087 0 ～ 1.740 0 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取上述混合对照品溶液5 μL，重复进样6次，按2.2.1项下色谱条件进样，测定峰面积。结果木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的 RSD分别为0.86%和 0.83%（n＝6），表明仪器精密度良好。

图4 十味木香散高效液相色谱图

稳定性试验：取批号为20140501的样品，制备供试品溶液，分别于 0，2，4，8，10，12 h 时进样 5 μL，测定峰面积。结果木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的 RSD分别为 1.04%和 0.99%（n＝6），表明供试品溶液在 12 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20140501）样品1 g，依法制备供试品溶液 6份，分别进样 5 μL，按 2.2.1项下色谱条件进样测定。结果木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积的 RSD 分别为 0.91% 和 0.73% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20140501，木香烃内酯含量为 2.093 mg／g，去氢木香内酯含量为 2.568 mg ／g）6 份，每份 0.5 g，精密称定，分别精密加入木香烃内酯、去氢木香内酯质量浓度分别为0.325 6 mg／mL 和 0.434 8 mg／mL 的混合对照品溶液各3 mL，依法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

取5批十味木香散，依法制备供试品溶液，分别进样记录峰面积值，并计算木香烃内酯和去氢木香内酯含量。以5批样品平均含量下浮20%作为本品的含量限度标准，故暂定本品每克含木香以木香烃内酯、去氢木香烃内酯的总量计不得少于3.59 mg／g。结果见表2。

表2 5批样品含量测定结果

3 讨论

本试验中通过对不同极性提取溶剂、提取方法及提取时间进行考察，建立了方中木香、马尿泡、人工牛黄的TLC鉴别方法；曾对方中的其他药味开展研究，但由于其阴性对照干扰较大或对照药材、对照品不易得到等原因，试验未成功。木香中木香烃内酯、去氢木香烃内酯的含量测定试验过程中，分别考察了以乙酸乙酯、氯仿、甲醇为提取溶剂的情况，结果显示，以甲醇为溶剂时的提取率高于乙酸乙酯、氯仿，因此选用甲醇为供试品提取溶剂；还考察以乙腈-水、甲醇-水为流动相时的分离情况，结果用甲醇-水溶液为流动相时基线较平稳，对被测组分峰无干扰，因此选择甲醇-水作为流动相。

方法学验证结果表明，本研究中建立了鉴别木香、马尿泡、人工牛黄的TLC法，分离效果好，阴性无干扰，同时建立了测定木香中木香烃内酯及去氢木香内酯含量的HPLC法，方法可行，操作简单，重复性良好，分离度好，阴性无干扰，故本研究中建立的方法可用于十味木香散的质量控制。