使用不同来源精子行卵胞浆内单精子注射对受精、胚胎发育及妊娠结局的影响▲

张小慧 黄悦悦 王世凯 谭卫红 毛献宝 李政达 周亭亭 韦娉嫔 刘庆友 薛林涛

(广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心，南宁市 530021，电子邮箱：zhangxhscu@163.com)

卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是通过显微操作手段将精子直接注射入卵子胞浆内，从而辅助其完成受精的治疗手段，其在临床上的成功应用有效地解决了因男方精子质量差、精卵结合障碍、无精子症等因素导致的不育问题。目前由于男方病因不同，ICSI治疗周期中用于显微注射的精子来源有所差异，而不同来源精子对ICSI治疗的正常受精率、胚胎发育参数及临床妊娠结局的影响，仍然存在争议[1-2]，且其机制仍不清楚。近年来有研究显示，精子功能参数异常是辅助生殖治疗正常受精率及临床治疗结局的一个重要影响因素[3]；同时不同来源精子由于其所处阶段及生理微环境的差异，精子功能参数可能存在差异[4]。本研究通过比较使用不同来源精子行ICSI对受精、胚胎发育及临床妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2010年1月至2016年11月在本中心接受ICSI技术治疗的703对不育夫妇临床资料。纳入病例均满足ICSI技术治疗的临床指征：(1)严重少弱精子症(精液浓度<5×106/mL或前向运动百分率<10%)；(2)前次体外受精失败或正常受精率<30%；(3)采卵当日精液经密度梯度离心处理后前向运动精子总数<1×106条；(4)男方为梗阻性无精子症。纳入标准：(1)女方年龄≤37岁；(2)女方经过体格检查、病史询问、妇科B超及内分泌、血液生化检查，除单纯输卵管因素外，未发现其他可能影响生育的疾病；(3)夫妇双方染色体核型分析未见异常。将体外射精采集精子的病例分为正常精液组(A组)56例，少弱精子症组(B组)364例；将手术从睾丸或附睾取得精子的病例分为附睾精子组(C组)187例，睾丸精子组(D组)96例。

1.2 方法

1.2.1 精液采集：男方禁欲2～7 d，在女方取卵当日上午采用手淫法采集精液，收集于清洁广口的塑料无菌杯中，用非连续密度梯度离心法结合上游法[5]行优化处理，37℃培养箱孵育备用。梗阻性无精男性于女方取卵当日，采用经皮附睾精子抽吸术或经皮睾丸精子抽吸术[6]采集精液，采用直接离心法[5]1 640 r/min离心5 min进行优化处理，去上清后37℃培养箱孵育备用。

1.2.2 精子DNA碎片率检测：使用精子染色质扩散法[7]检测优化后精子DNA碎片率，按照西班牙Halotech DNA S.L.公司的Halosperm®试剂盒(批号：4078105)说明书进行操作。精子DNA碎片化判定标准：精子头部产生光晕宽度小于精子核直径的1/3，或精子头部无光晕，或精子头部不着色或核形态不规则。精子DNA碎片率=DNA碎片化的精子数/精子总数×100%。

1.2.3 精子顶体完整率：采用异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素法[5]评估精子顶体功能。使用磷酸盐缓冲液将优化后精液浓度调整至5×106/mL，取10 μL均匀涂抹于干净载玻片上，自然干燥；将精子涂片置于95%的无水乙醇中固定30 min，自然干燥后置于25 μg/mL的荧光染料中4℃避光染色8～12 h；取出玻片，用去离子水轻微洗涤冲洗10 s后封片；450～490 nm激发光下使用400倍油镜观察精子涂片，至少计数400个精子。精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀则判定为顶体完整精子，精子仅在赤道带出现荧光带或者顶体区无荧光染色则判定为自发顶体反应精子。顶体完整率=顶体完整精子数/精子总数×100%。

1.2.4 ICSI受精：所有女方根据年龄、激素水平和卵巢储备功能行促排卵方案，当直径达18 mm及以上的卵泡数量≥2枚时，进行扳机，扳机36 h后行卵泡穿刺。取卵4～6 h后挑选形态好、活力正常的精子对每个成熟卵母细胞行ICSI。取卵后72 h参考卵裂期胚胎评分系统[8]，对卵裂期胚胎进行质量评估标准。卵母细胞受精后第5天、第6天，观察囊胚形成情况，参照人类囊胚评分系统[9]进行囊胚分级。根据子宫内膜情况行新鲜胚胎移植。胚胎移植后，第14天检测尿或血人绒毛膜促性腺激素，第4～5周B超检测孕囊和胎心，电话随访妊娠情况及产科结局。

1.3 观察指标 比较4组的精子DNA碎片率、精子顶体完整率、正常受精率、正常卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、可冻囊胚形成率、优质囊胚形成率、移植周期数、移植胚胎数、每周期移植胚胎数、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、活产率和男女婴性别比。其中正常受精率=2个原核受精卵数/注射成熟卵母细胞数×100%；正常卵裂率=2个原核卵裂胚胎数/2个原核受精卵总数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/2个原核卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养总数×100%；可冻囊胚形成率=可冻囊胚数/囊胚培养总数×100%；优质囊胚形成率=优质囊胚数/囊胚培养总数×100%；胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=B超观察到妊娠的周期数/移植周期数×100%；流产率=流产的周期数/移植周期数×100%；活产率=活产的周期数/移植周期数×100%；男女婴性别比=出生男婴数/出生女婴数。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。满足正态分布的计量资料以(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，不满足正态分布的计量资料以[M(Q1,Q3)]表示，比较采用秩和检验；计数资料以例数或百分比表示，比较采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组患者基本情况及精子参数比较 B组的男方年龄大于C组与D组，A组与B组的女方年龄均大于C组与D组(均P<0.05)。A组与B组精子DNA碎片率低于C组与D组，而精子顶体完整率高于C组与D组(均P<0.05)。见表1。

表1 不同分组患者基本情况及精子参数比较(x±s)

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

2.2 4组正常受精率与胚胎质量比较 A组的正常受精率高于B组、C组与D组，且B组的正常受精率高于C组(P<0.05)。B组的优质胚胎率、囊胚形成率和可冻囊胚形成率低于D组(P<0.05)。4组的正常卵裂率、优质囊胚形成率差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 不同来源精子正常受精率与胚胎质量对比

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05。

2.3 4组临床结局比较 4组每周期移植的胚胎个数、胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率和男女婴性别比差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组分临床结局对比

3 讨 论

精子在睾丸中生成时已经具有完整的父源遗传物质和功能活性的顶体蛋白酶，进入附睾并经头、体、尾运行后，精子核进一步成熟，同时顶体外膜抗原分布改变，最后精子通过生殖管道获得受精能力。不同来源的精子，精子核组装程度和顶体的成熟度不同，因此受精结局有所差异[10]。当精子核DNA损伤时，其进入卵子后精子核染色质解聚受到影响，进而影响受精，而高DNA碎片率与ICSI治疗的正常受精率呈负相关[3]。顶体内生物活性蛋白酶促进卵子激活和精子核染色质的解凝缩，从而促进受精[11]。本研究结果显示，4组的正常受精率差异有统计学意义(P<0.05)，其中A组、B组的正常受精率均高于C组，提示不同来源精子用于ICSI治疗，正常受精率存在差异；同时，A组、B组的DNA碎片率低于C组，而顶体完整率高于C组(P<0.05)，这提示由于不同来源精子的DNA碎片率和顶体完整率不同，可能导致ICSI的正常受精率存在差异。

胚胎发育到 4～8 细胞阶段时，合子基因组开始激活，父源基因对胚胎发育的影响开始显现。尽管有研究结果显示射出精子和睾丸精子的囊胚形成率和囊胚质量无明显差异[12-13]，但本研究结果显示B组的优质胚胎率、囊胚形成率和可冻囊胚率低于D组(P<0.05)。其原因可能有3个方面：首先，未成熟的精子生成后从生精小管向附睾迁移的过程中产生活性氧，引起精子氧化应激损伤，致使精子的结构和功能受损[14]，同时由于环境、生活习惯、肥胖、感染或者其他疾病等原因，少弱精子症患者精子的微环境变差，产生的超氧化物浓度高，精子氧化应激损伤更严重[15]，而睾丸中的精子中心粒等受损伤小[16]，使其所形成的胚胎发育潜能好；其次，本研究中睾丸精子来源于梗阻性无精子症患者，而大多数此类患者睾丸的生精功能正常，但少弱精子症患者多数生精功能受损，表观遗传异常，表观遗传通过调节基因表达和细胞的功能，最终影响胚胎的质量[17]；最后，射出精子的浓度和前向运动率与精子染色体的非整倍性呈负相关[18]，少弱精子症的染色体精子非整倍性升高[19]，非整倍性的精子导致胚胎染色体异常，少弱精子症患者的胚胎发育潜能比正常精液者差。因此，少弱精子症患者行ICSI治疗时所获胚胎的发育潜能差，临床上应予以重视。

本研究结果还显示，4组的胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、活产率、男女婴性别比差异均无统计学意义(P>0.05)，与赵杰等[20]的研究结果相同。这可能是由于用于ICSI的精子数量非常有限，故优先选择活力和形态最好的精子，以减小精子异常对ICSI结局的影响。精子进入胞质后可进一步进行生理选择，以顺利完成受精，并促进受精卵发育成优质胚胎。而临床胚胎移植时需要经过严格的胚胎质量筛选，挑选质量最佳的胚胎移植入宫腔，也从一定程度上淘汰染色体异常的胚胎，并减少精子缺陷对临床结局的影响。

综上所述，ICSI周期使用不同来源精子会导致精子DNA碎片率和顶体完整率存在差异，从而影响正常受精率。少弱精子症来源的精子可影响ICSI治疗周期的胚胎发育结局，因此少弱精子症患者进行ICSI治疗前，有必要进行精子功能检查评估，加强男科临床治疗，改善精子质量和功能，以提高临床治疗结局。