褐藻多酚提取、分离和抗氧化活性的研究进展

袁付红，赵丽丽，逄锦龙

（青岛明月海藻集团有限公司海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛266400）

近年来，海藻活性物质的开发和高值化应用掀起了研究热潮。褐藻是具有巨大应用潜力的经济海藻，资源丰富。褐藻中富含海藻多糖、蛋白质、多酚类、萜类、岩藻黄素、氨基酸、甘露醇、激素等活性物质。褐藻多酚是一类多羟基酚类化合物，也被认为是间苯三酚的衍生物，结构复杂。按照聚合度的不同，褐藻多酚可以分为小分子量褐藻多酚和高分子量褐藻多酚。小分子量褐藻多酚根据聚合方式不同，可以大致分为6 类（fucols，phlorethol，fucophloretols，fuhalols，eckols，halogenatedphlorotannins）[1-2]。理论上，高分子量褐藻多酚可以认为是由低分子量褐藻多酚进一步聚合而成，但由于分子量大时，更容易氧化，所以高分子量褐藻多酚的结构解析目前尚未有定论[3]。褐藻多酚是一种天然的抗氧化剂，未来将在海洋药物、功能食品和日化领域得到广泛应用。

1 提取方法

近年来，关于褐藻多酚提取工艺的研究增多，除了最经典的溶剂提取法外，还有超声提取、微波提取法、超临界提取法、酶解法、微生物法和超临界萃取法等多种提取方法。研究方向主要集中在提取工艺优化方面。

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是利用溶解度差异，通过选择合适的溶剂获得目标物质的方法。试验中主要以褐藻多酚提取率为优化指标，通过优化工艺参数，提高收率。曲词[4]研究发现影响海黍子多酚得率的因素依次为：温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比，提出最佳提取条件为70 ℃、乙醇浓度 50%、提取时间 8 h、料液比 1∶25（g/mL），此时总酚含量为5.955（mg 没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/g 干海藻）。何传辉等[5]优化了羊栖菜多酚的提取工艺，研究羊栖菜多酚的最佳提取条件为25%乙醇、提取时间 3 h、料液比 30∶1（m/v）、提取温度40 ℃时，多酚提取率达7.91 （mg GAE/g 干海藻）。Cahyaningrum 等[6]采用96%乙醇提取马尾藻多酚，提取物中总酚含量为（1.18±0.67）（mg GAE/g 干海藻）。许亚如[7]采用70 %乙醇提取铜藻多酚，总酚含量为3 698.617（μg GAE/g 干海藻）。Iwai[8]比较纯水和甲醇对提取昆布多酚的影响，结果表明采用甲醇提取时粗提物产率较低，但总酚含量在粗提物中约占30%，是采用水提取时的3.8 倍。Zahra 等[9]比较开水浸提和乙醇37 ℃浸提对马尾藻多酚收率的影响，测得总酚含量分别为 17（mg 儿茶酸/g 干海藻）和 0.9（mg 儿茶酸/g 干海藻）。栾莎[10]采用50%乙醇提取萱藻多酚，测得总酚含量为6.006（mg GAE/g 干海藻）。由此可见，乙醇水溶液是褐藻多酚提取研究中应用较多的溶剂，此外甲醇、丙酮、环己烷、乙醚也有少量研究者采用[11-14]。

1.2 超声波辅助提取法

超声波在介质中产生的空化现象能促使植物细胞组织的破碎、细胞壁的破壁或变形，产生的振动作用会加强细胞内物质的释放、扩散和溶解，使得提取更充分，一般提取率较溶剂提取法会显著升高。史建鑫[15]研究了超声辅助提取昆布多酚的工艺，发现当乙醇浓度 30%、料液比 40∶1（g/mL）、超声时间 32 min、超声温度35 ℃时，多酚提取率达4.485（mg GAE/5 g 干海藻），相比溶剂提取法（提取率为2.966 mg/5 g）提取率明显提高。Agregán 等[16]采用超声辅助提取法比较泡叶藻、墨角藻和角叉藻的多酚提取率，发现角叉藻的多酚提取率最高，为5.74（g 间苯三酚/100 g 干海藻）。超声提取法凭借其高效、节能的特点，已被广泛用于褐藻多酚的提取研究中。

1.3 微波辅助提取法

微波辐照是高频电磁波穿过提取介质进入植物细胞的过程，微波作用下细胞中某些成分与基体分离，同时细胞吸收能量后由于温度急剧上升而破裂，细胞液中的成分流出并扩散至介质中[17]。微波提取法选择性较好，且节能、省时，被誉为“绿色提取工艺”。史建鑫[15]采用微波辅助提取法提取昆布多酚，研究得到最佳提取工艺为乙醇浓度 30%、料液比 35∶1（g/mL）、微波功率450 W、微波时间100 s，随后70 ℃浸提30 min，此时多酚提取率达8.952（mg GAE/5 g 干海藻），相比超声提取法4.485（mg GAE/5 g 干海藻），提取率显著提高。王君虹等[18]采用微波辅助提取羊栖菜多酚，优化得到最佳提取工艺条件为80%乙醇、微波功率600 W、温度 70 ℃、料液比 1∶10（g/mL）、浸提时间 4 min，此时提取率达2.33%。

1.4 酶解法

酶解法中酶使细胞壁破裂，内容物溶出率增加，收率提高。酶解法具有作用条件温和、专一性较强的优点。刘楠等[19]研究纤维素酶和中性蛋白酶辅助提取羊栖菜多酚的工艺，将羊栖菜先进行酶解提取，再乙醇溶液浸提，优化工艺后多酚提取量为9.31（mg GAE/g干海藻）。曾帅[20]比较乙醇浸提和酶解法辅助提取羊栖菜多酚的效果，其中酶解法辅助提取是指先采用纤维素酶和中性蛋白酶提取，之后再用乙醇浸提。研究得到最优化提取条件为复合酶质量比20∶1、酶解pH 5.5、酶解温度50 ℃、酶解时间45 min，此时羊栖菜多酚的提取量能达到9.26（mg GAE/g 干海藻），相比单纯用乙醇浸提，提取率为8.26（mg GAE/g 干海藻）提取率有所提高。

1.5 微生物发酵法

微生物发酵法利用微生物或酶将细胞壁降解，使细胞液中的物质释放、溶解到提取液中，从而增加产率与速度。Eom 等[21]先用水提取获得艾森藻提取物，然后向提取物溶液中分别加入不同酵母菌种比较菌种及发酵时间对多酚含量的影响，结果发现当使用Yeast YM-1 菌种发酵1 d 时，总酚含量最高，同比不加菌种时的36.11（mg 间苯三酚/g 海藻提取物）升至47.51（mg间苯三酚/g 海藻提取物）。

1.6 超临界萃取法

超临界萃取法是海藻活性物质提取研究中比较新型的提取技术，该法的萃取剂主要是二氧化碳，利用温度和压力对超临界二氧化碳溶解能力的影响进行。Klejdus 等[22]采用超临界萃取法提取螺旋藻中的酚类物质，研究发现通过工艺优化可以提取到痕量酚类物质，大大提高收率，且无溶剂残留。Roh 等[23]采用二氧化碳和乙醇二元溶剂，研究了裙带菜多酚的提取工艺，当温度为333 K、压力为250 bar 时多酚提取率最高，最高时可达800 μg/g 左右。

2 分离方法

目前，褐藻多酚常用的分离纯化方法有溶剂萃取法、树脂分离法、凝胶层析法、色谱法和膜分离法。

2.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是指利用多酚及杂质在水相和有机相中的溶解度差异将其分离开来的一种方法。溶剂萃取法通常应用在含杂质较多的初步分离过程中。一般在溶剂萃取操作前，可以首先通过常温或低温静置，沉淀出一些固形物，或是通过加入大量有机试剂沉淀出不溶物，去除掉糖类、蛋白质等物质。曲词[4]比较石油醚、乙醚、氯仿和乙酸乙酯作为萃取剂时对水相海黍子多酚含量的影响，结果表明经萃取后，多酚含量均有所提升，其中乙醚-氯仿混合萃取剂的除杂效果最好，多酚含量最高，可达到3.62（mg GAE/g 干海藻）。卢虹玉等[24-25]采用正己烷和三氯甲烷洗涤莫氏马尾藻和全缘马尾藻粗提液。李亚娴[26]采用乙酸乙酯、石油醚和正丁醇分别等量萃取羊栖菜多酚粗提液，并比较水相和有机相中多酚含量差异，结果表明酚类多存在于水相中，有机相中含量很少，且随萃取剂极性的增大，有机相中酚含量增多。采用分级萃取法即对羊栖菜多酚粗提液先用乙酸乙酯萃取，分离后再用正丁醇萃取，并比较乙酸乙酯、正丁醇、水相中多酚纯度，发现纯度依序为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞水相。

2.2 树脂分离法

大孔吸附树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，有机化合物根据吸附力的不同和分子量的大小，经一定溶剂洗脱达到分离提纯的目的。李亚娴[26]采用ADS-21 树脂对经乙酸乙酯萃取后的羊栖菜提取液进一步纯化。曾帅[20]考察了 AB-8、DA-201、D141 及HP-20 4 种树脂对羊栖菜多酚提取液的分离纯化效果，发现AB-8 树脂的吸附率和解析率最高，最终采用AB-8 树脂对羊栖菜多酚进行纯化，经纯化后羊栖菜多酚纯度达到62.15%。张丽斌[27]研究发现采用XDA-7 树脂分离羊栖菜多酚时，多酚纯度能达到61.86%。Kim 等[28]比较了 HP-20，SP-850，XAD-7HP 和 XAD-2，4 种大孔树脂对腔昆布多酚纯化的影响，结果表明HP-20 具有较强的吸附脱附能力，经树脂纯化后，总酚含量由452（mg 间苯三酚当量（phloroglucinol equivalents，PGE）/g）上升到 905（mg PGE/g）。Haider 等[29]优化了柱色谱对马尾藻多酚分离纯化的影响，比较大孔树脂、硅胶柱和聚乙烯聚吡咯烷酮柱对分离纯化的影响，结果表明大孔树脂的效果最好，通过进一步优化动态吸附脱附条件，多酚粗提取物中多酚纯度达62.43%。

2.3 凝胶层析法

凝胶层析法是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分依照分子大小不同而被分离的技术。曲词[4]采用Sephadex LH-20 凝胶柱将海黍子多酚的中一种组分进一步分开得到2 种组分，而另一组分没有得到进一步分离，3 种组分多酚含量分别为4.57、5.28、6.61 mg/g。

2.4 色谱法

色谱法利用各组分对流动相和固定相亲和能力不同，使在流动相流过固定相过程中，连续的产生吸附与解吸，从而达到各组分互相分离的目的[30]。符晓杰等[31]采用waters 600e 液相色谱对海带多酚进行分析，共分离得到9 种组分。许亚如等[7]采用ODS（YMC S-50 μm，12 nm）色谱柱，依次用不同浓度的甲醇-水溶液将粗提物洗脱分离为不同极性部位组分。Kang 等[32]采用ODS 柱分离羊栖菜多酚，发现羊栖菜多酚是一种多酚混合物，分子质量在10 000 Da～400 000 Da；依次采用硅胶柱、高效液相色谱分离昆布多酚，发现昆布多酚为二昆布酚类的物质。Agatonovic-Kustrin 等[33-34]采用高效薄层色谱分离16 个海藻品种的提取物成分，提取物中含有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力和铁离子还原能力均较强的酚类物质。他还分别采用乙醇和乙酸乙酯提取马尾藻、粉团扇藻、小团扇藻和网地藻多酚，结合生物自显影法的薄层色谱分离并可视化提取物组分，采用DPPH 自由基衍生和三氯化铁衍生法考察各组分的清除DPPH 自由基活性和抗氧化活性。

2.5 膜分离法

膜是具有选择性分离功能的材料，膜分离是利用膜的选择透过性实现料液不同组分的分离、纯化[35]。顾丽霞等[36]采用不同分子质量的超滤膜包将水相和乙酸乙酯相中的羊栖菜多酚各分离成4 种不同分子量的组分。卢虹玉等[24，25]采用超滤膜包对莫氏马尾藻多酚提取物进行处理，将水相和乙酸乙酯相各分为大于10 kD和小于10 kD 分子量的两种组分：水相＞10 kD，水相＜10 kD，乙酸乙酯相＞10 kD 和乙酸乙酯相＜10 kD 的提取馏分分别记为 W1，W2，EA1 和 EA2，总酚含量相应为 1.672、1.319、0.096、0.143（mg GAE/g 干海藻）。对全缘马尾藻多酚提取物做类似处理后，W1，W2，EA1 和EA2 分别为 1.16、0.6、0.25、0.34（mg GAE/g 干海藻）。

3 抗氧化活性评价

褐藻多酚清除自由基的机制源于结构中含有丰富的酚羟基，可以作为供氢体或供电子体。抗氧化机理一般认为存在2 种途径，一是褐藻多酚作为供氢体与自由基作用，有效清除活性较高的自由基，生成活性较低的多酚自由基，终止原本的氧化链式反应，避免有害的过氧化物产生。二是作为供电子体，能够与起催化作用的金属离子如Fe3+、Cu2+作用，形成稳定的络合物，从而抑制和延缓氧化[37-38]。

抗氧化活性研究分为体内和体外试验2 种，目前，褐藻多酚的抗氧化研究基本上都是体外试验，体外抗氧化活性评价指标主要有清除自由基能力和抗氧化能力。其中清除自由基能力主要涵盖DPPH 自由基清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、氧化自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、单线态氧清除能力。抗氧化能力主要涵盖铁离子还原能力、抑制亚油酸过氧化能力、抗脂质过氧化能力、磷钼络合物法评价抗氧化能力。

3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基的乙醇溶液显紫色，在517 nm 处有吸收。当有自由基清除剂存在时，会与之发生反应，变为黄色，根据517 nm 处吸光度值的变化可以计算得到清除率。

3.2 羟基自由基清除能力

羟基自由基在530 nm 处有紫外吸收，当与抗氧化剂作用时，羟基会被清除，从而吸光度降低，通过测定530 nm 处吸光度值的变化可以计算得到清除率。

3.3 超氧阴离子自由基清除能力

超氧阴离子（O2-）与特定化合物作用会产生光谱吸收，抗氧化物质与O2-作用使得吸收减弱，以此评价物质的清除O2-能力。

3.4 氧化自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）

ORAC 法是根据自由基会破坏荧光探针，当抗氧化物存在时，抗氧化物质会与自由基作用，抑制荧光变化，以荧光强度变化反映自由基的数量。

3.5 2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力

ABTS+在氧化剂作用下生成绿色的ABTS+自由基，当抗氧化物存在时，ABTS+自由基的产生受抑制，通过测定在405 nm 处的吸光度变化来评价ABTS+自由基清除能力。

3.6 单线态氧清除能力

单线态氧是由光敏剂将基态氧激发产生的，单线态氧能与发光试剂作用而发光，通过测定发光强度变化来评价清除单线态氧能力。

3.7 铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）

Fe3+-三吡啶三嗪（ferric-tripyridyltriazine，Fe3+-TPTZ）试剂与抗氧化物作用生成蓝色的Fe2+-TPTZ，通过在593 nm 处测定吸光度变化获得样品的总抗氧化能力。

3.8 抑制亚油酸过氧化能力

亚油酸过氧化的产物有毒，可能会产生致癌、致畸作用。抑制亚油酸过氧化能力是衡量物质抗氧化能力的一个重要指标，一般通过底物的消耗或氧化产物的生成来评价氧化的程度。

3.9 抗脂质过氧化能力（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）

活性氧与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应，生成丙二醛（malonaldehyde，MDA）、4-羟基壬烯酸等，使细胞膜流动性和通透性改变，最终使细胞结构和功能发生改变。MDA 含量是衡量脂质过氧化程度的重要指标，硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）可与MDA 反应生成红色物质，在532 nm 处有最大吸收，通过比色法可以得到多酚的抗脂质过氧化能力。

3.10 磷钼络合物法

磷钼试剂与抗氧化物质作用生成磷钼蓝络合物，蓝色的深浅代表抗氧化物的抗氧化能力的大小。

刘晓丽等[37]研究发现海带多酚对DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基都有较强的清除活性。并且，羟基自由基清除能力显著高于茶多酚和L-抗坏血酸，DPPH 自由基清除能力与茶多酚相当，抑制亚油酸过氧化能力显著高于茶多酚和α-生育酚。曲词[4]发现海黍子多酚的DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力以及还原能力均随浓度的增大而升高，其中一种组分的DPPH 自由基清除能力可达91.92%，羟基自由基的清除能力可达81.37%，海黍子多酚的超氧化阴离子自由基清除能力和还原能力与VC相当。各组分ORAC 值差异较大，最大时能达到VC的3.9 倍。史建鑫[15]发现昆布多酚的DPPH 自由基和羟基自由基清除能力高于VC低于茶多酚，超氧阴离子清除能力高于茶多酚低于VC。曾帅[20]发现纯化后的羊栖菜多酚的总抗氧化能力和DPPH 自由基清除能力均高于VC和VE。Kang 等[32]研究羊栖菜多酚和昆布多酚的抗氧化性能，结果表明羊栖菜多酚和昆布多酚均具有较强的DPPH 自由基清除能力和铁离子还原能力，其抗氧化性能均高于常见的抗氧化剂如儿茶酸、VE、丁基羟基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）和BHT（butylated hydroxytoluene，BHT）。另外，喇叭藻多酚、马尾藻多酚和萱藻多酚均被发现具有较强的抗氧化活性[6，10，39]。

4 抗氧化活性影响因素

4.1 与多酚含量有关

褐藻多酚抗氧化活性与多酚含量有关，当其他条件相同时，在一定浓度范围内，随着多酚浓度的增大，抗氧化活性增强[40-41]。

4.2 与藻种类有关

Agregán 等[16]比较泡叶藻、墨角藻和双叉藻的抗氧化活性，结果表明双叉藻具有较强的氧化自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力和铁离子还原能力。许亚如等[7]研究多种海藻提取物的抗氧化活性，发现多酚含量由大到小依次为F 藻＞泡叶藻＞铜藻＞树皮藻＞面条藻＞N 藻，其中 F 藻多酚含量为 808.53（mg/100 g 干海藻）；比较不同藻类提取物的DPPH 自由基清除能力，由大到小依次为铜藻＞F 藻＞面条藻＞树皮藻＞N 藻＞泡叶藻；不同藻类提取物的ABTS+自由基清除率由大到小依次为铜藻＞F 藻＞面条藻＞树皮藻＞泡叶藻＞N 藻；单线态氧清除能力以泡叶藻最为显著；不同藻类提取物的FRAP 值由大到小依次为铜藻＞泡叶藻＞面条藻＞树皮藻＞N 藻＞F 藻；铜藻和面条藻的 ORAC 较高，氧化自由基清除能力较强。栾莎[10]比较萱藻、孔石莼、缘管浒苔、鼠尾藻、海带、裙带菜和紫菜提取物的抗氧化能力，结果表明不同种类海藻提取物的清除羟基自由基能力、清除超氧阴离子能力、铁还原能力、抗脂质过氧化能力大不相同。

4.3 与组织结构有关

许亚如等[7]发现羊栖菜气囊中的多酚含量高于茎中的和整个粗提物的，通过进一步研究表明褐藻多酚的分布并没有组织结构差异，推测是由于气囊比表面积大的缘故。

4.4 与多酚极性有关

Rajauria 等[38]研究了20%～80%甲醇水溶液作为提取剂时对伸长海条藻多酚抗氧化活性的影响，结果表明60%甲醇溶液萃取得到的伸长海条藻多酚具有最强的还原能力、清除DPPH 自由基能力、抗脂质过氧化能力。杨小青等[42]发现在分子量相同的前提下，乙酸乙酯相中的羊栖菜多酚的抗氧化能力强于水相的。EI-Aty 等[43]比较甲醇、丙酮和水3 种不同极性溶剂作提取剂时，对阿氏颤藻和鱼腥藻多酚含量和抗氧化活性的影响，结果表明阿氏颤藻甲醇提取液的多酚含量最高且抗氧化性最强。栾莎[10]发现不同比例的水-乙醇溶剂获得的萱藻多酚提取物清除羟基自由基、超氧阴离子、DPPH 自由基清除能力、铁还原性、抗脂质过氧化能力不同，这可能与溶剂不同时，提取出的生物活性物质不同，加上可能有交互作用影响，导致其抗氧化活性有所差别。

4.5 与分子量大小有关

卢虹玉等[24-25]在莫氏马尾藻多酚和全缘马尾藻多酚抗氧化能力研究中，发现大分子馏分抗氧化能力优于小分子馏分。杨小青等[42]发现水相和乙酸乙酯相中羊栖菜多酚含量随分子量的降低而降低，表明羊栖菜多酚主要以高分子形式存在；乙酸乙酯相中高分子量羊栖菜多酚的综合抗氧化活性最好，这可能由于高分子量多酚所带的酚羟基数量更多的原因。

4.6 与藻干燥方式有关

Dang 等[44]研究了6 种干燥方式对喇叭藻提取物总酚含量和抗氧化活性的影响，结果表明总酚含量在冻干、去湿度和真空干燥时数值明显较高，抗氧化能力较强。而日晒、微波和烘干则由于电磁波辐射、高温或空气氧化原因使得多酚易于降解。试验发现采用冻干方式时多酚含量最高为21.11（mg GAE/g 干海藻），铁还原能力、清除DPPH 自由基和清除ABTS+自由基能力最强。

5 展望

褐藻多酚具有较强的抗氧化能力，其抗氧化能力相当或优于儿茶酸、VC、VE、BHA 和 BHT，是一种天然的抗氧化剂。目前，褐藻多酚抗氧化研究主要集中在提取分离工艺优化和抗氧化活性评价方面，关于改性方面的研究较少，还有待进一步研究。褐藻多酚尚未工业化生产，寻找适合工业化生产的提取分离技术，有选择的定向利用褐藻多酚，是未来褐藻多酚产业化面临的重大难题。另一方面，随着对褐藻多酚结构解析的深入，化学合成法或将成为褐藻多酚工业化生产的一条有效路径。