红枣多糖提取、分离与纯化研究进展

杨燕敏，高琳，张仁堂，张东旭，郑振佳

（山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安271018）

红枣（Ziziphus jujuba Mill.），又名中华大枣，是鼠李科枣属植物枣树的果实[1]。枣树在我国已有四千多年的栽培历史，主要分布在西北地区、黄河流域地区和东部地区[2]。我国主要的品种有冬枣、金丝小枣、和田玉枣、壶瓶枣、长枣和灰枣等。红枣营养丰富，具补虚益气、养血安神与健脾和胃等多种保健功能[3]，有“日食三颗枣，终身不显老”之说。多糖是红枣中一种重要的生物活性物质，研究表明红枣多糖具有抗氧化、降血脂和保肝等多种生物活性[4]，逐渐受到人们的关注。因此红枣多糖相关的产品加工具有广阔的发展前景。

多糖，又称多聚糖，是由醛糖或酮糖通过苷键链接在一起的天然高分子化合物[5]。目前提取多糖的主要方法有：水提法、超声辅助浸提法、微波辅助浸提法、酶提法和碱液提取法等[6]。对近年来大枣多糖的提取、除杂质和分离纯化方法的研究现状进行了综述，为植物多糖的相关研究及开发利用提供参考。

1 红枣多糖的提取

1.1 热水提取

热水提取法是常用的方法，提取溶剂主要有水和碱液，该方法具有简单、方便、成本低等优点，缺点为时间长、效率低以及多糖易降解[7]。采用碱液辅助热水提取多糖可以提高粘多糖以及酸性多糖的溶解度，提高提取率。陈国梁等[8]用热水浸提法研究浸提温度、料液比、提取时间3 因素对冬枣多糖提取的影响，确定了最佳工艺参数：温度为 90 ℃、料液比为 1∶15（g/mL）时提取率最佳，而提取时间对多糖得率无明显影响。潘莹等[9]用热水浸提法在 100 ℃按料液比 1∶25（g/mL）提取4 h 提取粗多糖。李杰等[10]采用热水提取法提取敦煌圆枣中的多糖，通过试验分析影响热水提取法提取红枣多糖提取率的因素顺序为：时间＞温度＞料液比，确定了较优工艺参数为：提取时间3.5 h，提取温度95 ℃，料液比 1∶12（g/mL）浸提 2 次，多糖提取率可达 2.53%。杨云等[11]采用正交研究碱液提取大枣多糖，其各因素对多糖提取率的影响大小为：提取温度＞提取时间＞溶剂体积＞碱的种类，最佳提取工艺为：将 20∶1（mL/g）的0.5 mol/L Na2CO3溶液与枣渣体积置于80 ℃浸提3 h。

1.2 超声辅助提取

超声辅助提取法是通过频率在20 kHz 以上的超声波对媒质产生机械振动和空化作用破碎细胞提高多糖的提取率[12]。李福帅等[13]在单因素试验基础上，利用响应面分析法对超声辅助提取长红枣多糖试验进行优化，试验得出影响红枣多糖提取率的因素顺序为：超声温度＞超声时间＞料液比，最佳提取工艺参数为：料液比 1∶16（g/mL），超声温度 50 ℃，超声时间30 min，提取所得长红枣多糖得率为15.12%。Li 等[14]采用方法学优化超声提取条件，结果表明：最佳提取条件是温度45 ℃～53 ℃、声波功率为31.7 W、时间为20 min、水固比 20∶1（mL/g）。黎云龙等[15]用超声辅助热水提取骏枣多糖，用响应面法设计优化了工艺参数，试验所得最优工艺参数为：水提取温度83 ℃、提取时间4 h、液固比 17∶1（mL/g），骏枣粗多糖得率为9.51%。和热水提取法相比不仅缩短了提取时间并且在多糖得率方面也有所提高。超声辅助提取红枣多糖与热水浸提法相比有着提高多糖提取率，缩短提取时间，提取方法简便易行的优点[16-17]。

1.3 微波辅助提取

微波是频率介于300 MHz 和300 GHz 之间的电磁波，作用于植物细胞壁，其热效应促使细胞膜酶失去活性和细胞壁破裂以提取多糖的方法[12]。白艳林等[18]用微波辅助提取法提取山西红枣中的多糖，在单因素基础上设计响应面分析法优化试验，结果表明最优工艺参数为：提取时间 5.5 min，液料比 37∶1（mL/g），微波功率830 W，提取次数为3，多糖的提取率为6.78%。李新明等[19]用响应面优化微波辅助提取红枣多糖的参数为：微波功率 800 W，液料比 8∶1（mL/g），提取时间75 min，提取次数为3；在此条件下多糖提取量为27.28%。Rostami 等[20]研究了微波辅助浸提法提取大枣多糖，得到在微波功率400 W、提取温度75 ℃、提取时间 60 min 时，以液料比 30∶1（mL/g）为最佳条件，可获得多糖最大提取率。

1.4 酶法辅助提取

酶提取法常用的酶有果胶酶、蛋白酶、纤维素酶等，酶类可以分解细胞壁结构，加速多糖释放和提取[12]。吴洪斌等[21]利用纤维素酶对新疆红枣进行多糖提取，运用响应面优化工艺参数，提高多糖提取率，试验所得最佳提取条件为：酶添加量0.85 mg/mL、酶解时间 60 min、酶解温度 50.0 ℃、液料比 10∶1（mL/g），其多糖提取含量达7.71%。石勇等[22]以红枣为材料比较热水提取法和酶提取法，热水提取红枣多糖时间为6 h，多糖得率为2.69 %；利用同等单位复合的果胶酶、纤维素酶、蛋白酶对红枣中的蛋白质、纤维素等进行酶解处理，获得提取红枣多糖的最佳条件为：提取温度48 ℃、提取时间2.2 h、复合酶添加量1.0%，多糖提取率为4.61 %，复合酶法提取效果优于热水提取法的结论。

2 多糖的分离纯化

2.1 蛋白的去除

蛋白质约占红枣中干重的3.3%[23]，与多糖同为亲水性大分子物质，在多糖提取过程中会大量存在。去除蛋白质的方法有Sevage 法，三氯乙酸法和酶解法等。Sevage 法利用蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性而不溶于水的特性离心除去蛋白质，此法对多糖的性质影响较小但提取效率比较低。三氯乙酸法的原理是蛋白质中的疏水基团可以与三氯乙酸反应使蛋白质变性而相互凝聚沉淀，离心去除[24]，此法操作简单但酸性强，可能引起多糖的降解。酶解法是采用蛋白酶可以分解蛋白质达到去除蛋白质的效果，具有反应条件温和，提取效率高的特点。杨斌等[25]以蛋白清除率和多糖保留率为指标比较了Sevage 法、三氯乙酸法、酶解法对多糖除蛋白效果，结果表明：酶法蛋白清除率（56.57%）＞Sevage 法（47.47%）＞三氯乙酸法（45.13 %），其多糖保留率（98.16%）＞Sevage 法（67.65%）＞三氯乙酸法（61.05%）。孔繁东等[26]以蛋白质清除率和多糖保留率为指标，研究Sevage 法、酶法、酶法-Sevage 法联用、三氯乙酸法4 种方法对多糖除蛋白的比较。结果表明：酶-Sevage 结合法蛋白清除率（90.4334 %）＞酶法（80.7644%）＞Sevage 法（65.64%）＞三氯乙酸法；三氯乙酸法多糖保留率（96.1002%）＞酶法（95.2901%）＞酶-Sevage 结合法（91.9932%）＞Sevage 法（65.64%）。

2.2 脱色

色素也是多糖提取中的主要杂质，脱色的常用方法有活性炭脱色法、双氧水法、树脂脱色法等。活性炭是靠范德华力对色素颗粒的吸附作用使其与目标物质分离而达到脱色目的[27]。双氧水在水溶液中可电离出过氧氢根离子攻击色素，利用H2O2的氧化性使有色物质脱去原有色素[28]。树脂是一种吸附性质的脱色剂，具有稳定性高，吸附速度快等特点。潘莹等[9]用活性炭脱色和树脂（LS-850、AB-8 和 D-101）脱色 2 种脱色方法对冬枣多糖进行脱色，结果表明：活性炭法脱色率（78.71%）＞D-101（46.08%）＞LS-850（20.77%）＞AB-8（14.75%），活性炭法多糖保留率（90.22%）＞AB-8（90.12%）＞D-101（83.00%）＞LS-850（80.05%），活性炭脱色效果明显高于树脂（LS-850、AB-8 和D-101）脱色。蒋俊等[29]先后比较了大孔树脂（D315 和D303）脱色、双氧水脱色和活性碳脱色3 种脱色对多糖的脱色效果的影响，结果表明，大孔树脂D303 脱色率（86.2%）＞D315（59.4%）＞双氧水（48.7%）＞活性炭（22.1%）；活性炭多糖保留率（89.1%）＞D315（84.4%）＞D303（75.5%）＞双氧水（72.2%），大孔树脂（D315 和D303）脱色法明显优于双氧水脱色和活性炭脱色。

2.3 柱色谱分离

柱色谱分离方法主要有：凝胶柱层析法、离子交换层析法和大孔树脂柱层析等。凝胶柱层析的分离原理是按物质的大小进行分离[24]；离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子发生交换，使离子交换层析介质达到分离和纯化的方法[30]，大孔树脂层析是通过物理吸附可选择地吸附分离提纯物质。陈晋芳[30]先进行DE-52 离子交换柱层析，通过不同浓度的离子洗脱后，得到不同的大枣多糖组分；再进行采用Sephadex G-100 柱层析，进一步得到分子量大小不同的大枣多糖组分：JP1、JP3、JP3a 和 JP3b。李小平[31]采用 DEAE-纤维素离子交换柱层析法对枣多糖进行了组分分析，得到了5 种多糖组分。陈晴晴等[32]选出DM-18 型大孔树脂为分离沙枣多糖的分离材料，在最佳分离条件下，DM-18 型大孔树脂对沙枣多糖的吸附率达90.23%，解吸率达92.37%，得出纯化多糖的纯度为70.56%。Zou 等[33]用DEAE-52 纤维素阴离子交换柱和Sephadex G-200 柱层析法分离纯化了灰枣中的HP1 和HP2 两种酸性多糖。

3 多糖含量的测定

多糖含量测定传统的方法有苯酚-硫酸法和蒽酮比色法，文献最早可追溯至1983年[34-35]。苯酚硫酸法[36]是利用在硫酸的作用下多糖先水解成单糖，脱水生成糖醛衍生物后与苯酚生成橙黄色化合物，进行比色法测定。蒽酮比色法[37]原理是糖遇浓硫酸会脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物可与蒽酮发生反应生成蓝绿色的络合物，在620 nm 处有最大吸收，颜色的深浅与糖含量有关。王文洁等[38]比较蒽酮比色法与苯酚-硫酸法测定多糖含量的差异，蒽酮比色法测得多糖含量为27.79%，稳定性相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.11%，精密度和重现性RSD 为1.00%；苯酚硫酸法测得多糖含量为22.06%，稳定性RSD 为0.22%，精密度和重现性RSD 为1.31%，得出2 种测定方法均稳定可行、操作简便、准确可靠。

仪器分析方法主要有示差法、蒸发光散射检测法、柱前衍生化法等，此类检测方法主要是将多糖水解后进行单糖组成测定。示差折光检测器根据流通池内的化合物折射率不同的原理而对样品进行检测，常与高效液相色谱仪连用检测糖类[39]，对糖类检测灵敏度较高。蒸发光散射检测器是将柱洗脱液雾化形成气溶胶，在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测的检测器[40]。衍生化是利用化学反应改变目标化合物分子中的原子或官能团，通过检测新生产物对目标化合物进行气相色谱定性和定量分析[41]。申明月等[42]采用AKTA Puri-fier-100 生物分子纯化系统对多糖进行纯化，高效液相色谱-示差折光检测法进行了纯度检测，得出纯化的最佳条件：上样量5 mL，超纯水洗脱，流速2.6 mL/min，纯度大于99%。Li 等[43]用蒸发光散射检测器和高效液相色谱连用测定了低聚果糖的含量，在West-XBig 酰胺柱上进行梯度洗脱，它们的检测限（limit of detect，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分别低于 3.63 μg/mL 和 24.82 μg/mL，回收率在99.2%～102.6%之间。郝蕾蕾等[44]以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）作为衍生剂，用高效液相色谱法分析了黄河滩枣多糖的单糖组成及摩尔比为D-半乳糖醛酸（0.27）、L-鼠李糖（0.50）、D-甘露糖（0.54）、L-阿拉伯糖（1.00）、D-葡萄糖（2.03）、D-半乳糖（5.40）。Wang 等[45]采用高效液相色谱-质谱联用法对PMP 衍生后多糖含量进行测定。

4 存在问题以及发展前景

红枣多糖具有广泛的生物活性和广泛的研究价值。目前研究中主要存在以下问题：一是由于提取过程中的粗多糖与蛋白质、色素等杂质共存，在去除杂质的同时会有部分多糖损失；二是多糖种类繁多、结构复杂，多糖的结构确证难度大；三是对于多糖活性的研究主要集中于粗提物，对于多糖的组成和精准功能评价的研究较少。此外，黑变红枣是红枣通过固态发酵精深加工的一种产品，发酵后多糖的变化以及功能性评价研究也亟待开展。因此，寻找建立多糖的高效提取、分离纯化和检测方法仍旧是今后研究的重点。多糖具有生理活性广泛与低毒性的特点，随着生活水平的提高和健康的意识增强，在食品、药品以及保健品领域将会有广阔的市场前景。