γ氨基丁酸改善睡眠作用机制的研究进展

李 科,俞兰秀,刘小雨,刘 冬,张惟广,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.深圳职业技术学院应用技术研发院,广东深圳 518055;3.绿雪生物工程(深圳)有限公司,广东深圳 518105)

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一种广泛分布于动、植物体内的小分子量非蛋白质氨基酸,分子式为C4H9NO2,分子量为103.12 Da,水溶性强,热稳定性高,微溶于热乙醇,不溶于乙醚等有机试剂,其晶体形态呈白色片状或针状[1]。GABA在溶液中常以两性离子(带负电荷的羧基和带正电荷的氨基)形式存在,由于正负电荷基团间的静电相互作用,使得GABA在溶液中能够兼具气态(折叠态)和固态(伸展态)时的分子构象,而GABA在溶液中多分子构象共存的形式,使其能够结合多种受体蛋白并发挥多种重要生理功能[2]。Diana等[3]就不同食品中的GABA含量及其生理功能进行综述,指出食用含有一定量GABA的茶叶、发酵乳、巧克力、小麦胚芽、发酵肉制品等食品,具备改善睡眠、改善抑郁、促进放松、改善炎症、降血压、提高免疫力、增加脑部蛋白分泌等多种生理功能。

大脑中GABA、褪黑素、谷氨酸等神经递质的含量水平及其受体功能,对调节睡眠发挥着不同作用,当外源注入上述递质时,能够增加与该递质相关的睡眠时相,同时这些神经递质彼此紧密联系,相互影响,共同维持着睡眠-觉醒行为[4-5]。人每天将近1/3的时间用于睡眠,良好的睡眠对缓解疲劳、维持身体健康发挥着积极作用,通常个体睡眠受其情绪状态、年龄阶段、生活习惯、劳动强度、药物接触等因素影响[6]。失眠是一种常见的睡眠障碍,其发生与躯体疾病、压力、焦虑和抑郁状态等密切相关[7]。常人受到压力等应激源刺激时,其下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)活性增加,而长期的应激刺激,使得HPA轴活性持续异常亢奋,会导致机体出现抑郁或焦虑,进而诱发失眠[8]。研究发现,大脑中GABA含量水平的降低,与焦虑症、抑郁症、癫痫、帕金森等精神心理障碍或中枢神经系统疾病的发生存在一定关联[9]。此外,GABA作为一种中枢神经系统抑制性神经递质,能在GABA转氨酶作用下,经由GABA旁路(GABA-shunt)进行分解代谢,而其中间代谢产物的γ-羟基丁酸(GHB),可通过作用细胞膜上的GHB特异性受体、GABA-B受体或5-羟色胺能神经系统等途径,发挥对中枢神经系统兴奋性神经元的抑制作用,进而对机体产生镇静催眠等效果[10]。

当前,GABA的食用安全性已获得包括美国、日本在内等国家的广泛认可,我国也于2009年,将其认定为一种新食品原料,并可用于饮料、糖果、巧克力等食品的生产[11-12]。相关研究[13-15]证实,外源摄入一定量的GABA具备改善睡眠的生理功效。本文综述了GABA通过肠-脑轴、脑组织透性及其体内代谢物在改善睡眠方面的作用机制。

1 GABA通过肠-脑轴在改善睡眠方面的作用机制

肠-脑轴是肠道与大脑之间由神经通路、内分泌和免疫共同构成的一个复杂双向信息交流系统,其双向交流途径涉及迷走神经途径、神经内分泌途径和免疫途径[16]。

1.1 迷走神经途径

相关研究[17]指出,通过刺激生物体迷走神经外周端(如经皮耳迷走神经电刺激),可提升其脑部GABA含量水平。并且迷走神经刺激术(transcutaneous vagus nerve stimulation,tVNS)对治疗失眠、癫痫、抑郁等病症具备一定效果[18-19]。在被喻为“第二大脑”的肠神经系统中含有4～6亿个肠神经元,其中约20%的神经元为初级传入神经元,这些神经元可通过迷走神经途径,实现肠神经系统与中枢神经系统间信息的双向交流[20-21]。实验发现,在小鼠胃肠道迷走神经传入神经元结状神经节(nodose ganglion,NG)部位,编码GABA-B型受体1(Gabbr1)的基因具有相对高水平的转录表达,因而能对GABA产生相应的信号感知,经迷走神经途径上行传递后,影响大脑功能,发挥生理功效[22]。此外,还有研究表明GABA能够作用肠嗜铬细胞(EC细胞)并促使其分泌释放5-羟色胺(5-HT),而5-HT在作用肠黏膜的迷走神经末梢的相应受体后,能对其放电活动产生刺激作用[23]。此外,刺激迷走神经,还能促进5-HT透过血脑屏障,提高中枢神经系统的5-HT浓度,而临床上也常用5-HT再摄取抑制剂用于治疗抑郁和改善睡眠障碍[19]。有动物研究[24]显示,在给予小鼠喂食活性鼠李糖乳杆菌(JB-1)后,可通过迷走神经途径,改善强迫游泳应激后小鼠的焦虑和抑郁样行为,同时上调其脑部海马区中GABA-A受体α2亚型的表达。大脑中,海马等部位是参与情绪处理及认知的重要脑区,而GABA-A受体具备镇静安眠、抗焦虑等药理作用,特别是在其α亚型等受体表面分布有巴比妥类或苯二氮卓类镇静催眠药物的结合位点。临床研究表明,焦虑、抑郁和失眠成正相关,三者常相伴存在,缓解机体焦虑和抑郁有助于改善失眠[25]。已知,包含短乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌等在内的多种乳酸菌能够通过谷氨酸脱羧酶(GAD)途径内源合成GABA[26]。有研究指出,鼠李糖乳杆菌(JB-1)也同样具备GABA合成能力[27]。Janik等[27]利用磁共振波谱学技术(magnetic resonance spectroscopy,MRS)进行在体测定发现,在持续一月每日灌胃小鼠200 μL(含JB-1活菌数1×109CFU)活菌液后,喂食活性JB-1菌的小鼠脑部,其GABA含量由喂食前的(1.2±0.1) mmol/L增加至(1.5±0.2) mmol/L(p<0.01),提升了25%。虽然在动物实验中展现了活性JB-1菌对模型小鼠具有良好的生理效果,但还无法明确其结果多大程度上源于该菌所产的GABA,因而后续可考虑以喂食灭活或经基因敲除GAD酶基因片段的活性JB-1菌作为对照。而有实验[14]表明,在灌胃小鼠一定量的GABA和五-羟色氨酸(5-HTP)后,能极显著的缩短小鼠睡眠潜伏期并延长总睡眠时间(p<0.01),并且由实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析得知,实验组小鼠大脑皮层GABA-A受体转录水平高于对照组1.37倍。暗示外源摄入GABA可通过肠-脑轴中迷走神经途径影响中枢神经系统中GABA含量水平及其受体表达,进而发挥其改善睡眠等功能[13]。

1.2 神经内分泌途径

研究发现,外源摄入GABA能够提高机体的抗应激能力,而机体长期处于应激状态,会出现睡眠障碍、情绪异常等问题[28-29]。在外源应激刺激作用下,神经系统能够影响内分泌系统的激素分泌,下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)是机体应答外源应激刺激的重要组成部分[30]。Gao等[31]发现,持续的应激会损害小鼠下丘脑室旁核(PVN)中GABA能系统对促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)相关神经元的抑制,而PVN中GABA-A受体的激活,可有效抑制HPA轴活性以及血浆皮质酮含量的上升。此外,肾上腺组织也有发现GABA-A亚型受体的存在[32]。据一项动物试验结果显示,外源摄入GABA能够抑制应激后机体HPA轴活性以及CRH和糖皮质激素含量水平[33]。Farzi等[34]报道,生物体长期暴露于压力等应激源刺激,会致其HPA轴活性持续异常亢奋以及血浆皮质酮含量异常升高,进而诱发焦虑或抑郁样行为;此外应激所引发免疫系统炎性介质的产生,还会进一步刺激HPA轴活性的过度亢奋。前述提及的焦虑、抑郁和失眠常相伴发生,因而GABA能通过神经内分泌途径缓解应激所致的焦虑或抑郁状态,进而改善睡眠。

1.3 免疫途径

人体内约70%的免疫细胞,分布于肠道相关淋巴组织(GALT),GABA作为一种有效的免疫调节分子,可作用肠道中不同免疫细胞的GABA受体,介导其炎性相关细胞因子的产生[35]。例如GABA可作用免疫系统中小胶质细胞的GABA-B受体或巨噬细胞的GABA-A受体,抑制其促炎性细胞因子(白细胞介素-12)的生成[23]。研究发现,GABA还能作用位于十二指肠、空肠等肠组织部位的GABA受体,改善炎性肠病[36]。据报道,机体炎症反应所引发核转录因子NF-κB的激活,会抑制生物钟系统内核心钟组分Per、Cry等负调节基因的表达,损害生物钟系统的周期性振荡,致使生物体昼夜节律紊乱,从而扰乱其正常的睡眠-觉醒周期[37]。而GABA可通过免疫途径,改善炎症反应,降低促炎性细胞因子的生成及其对HPA轴的刺激,从而参与睡眠活动的调节。

2 GABA通过脑组织透性在改善睡眠方面的作用机制

经口摄入的GABA要到达中枢神经系统,首先需要由消化道进入血液循环。小肠是人体内实现营养物质消化与吸收的重要部位,其内皮细胞间存在与血脑屏障(blood brain barrier,BBB)中脑微血管内皮细胞间的类似紧密结构。但不同于后者的是,在小肠绒毛或隐窝部位的肠内皮细胞间,分别存在不同直径的孔隙(0.4～0.9 nm;5.0～6.0 nm),一些亲水性小分子物质可借此直接透过肠内皮细胞屏障[38]。相关研究[39-40]表明,在小鼠十二指肠、回肠等肠组织部位以及人肠上皮细胞模型Caco-2中均有GABA转运蛋白的存在。林智等[41]利用14C放射性自显影法研究GABA在小鼠体内的吸收,结果表明在对小鼠灌胃[14C]-GABA的60 min后,小鼠脑部区域即显示有放射性信号的存在,暗示GABA可经胃肠道进入血液循环。同时一项关于GABA的人体试食实验结果[13]显示,在10名受试者经口摄入200 mg食品级GABA的30 min后,受试者血液中GABA平均浓度由摄入前的244 nmol/L显著上升至329 nmol/L(p<0.05),由此进一步证实经口摄入的GABA可由生物体消化道进入血液循环。

在人脑部的血液和脑组织间,存在着血脑屏障(BBB)、血液-脑脊液屏障(BCSFB)和蛛网膜屏障的三类屏障[42]。其中最为重要的BBB是由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞等构成的一类动态屏障系统,其在保护中枢神经系统免受有毒物质侵害的同时,也成为了一些针对中枢神经系统疾病药物或其它有益分子透入脑组织的障碍[42]。早期,Roberts等[43]将溶有75 mg GABA的生理盐水(0.5 mL),经静脉注入老鼠体内,通过在注射后的不同时间点对其脑组织取样,进行纸色谱法分析发现,实验鼠脑部GABA含量与对照组无显著差别,由此推测GABA可能不具备BBB透性。Kuriyama等[44]则利用同位素标记法,将[3H]-GABA经腹腔注入小鼠体内,并以注入GABA转氨酶(GABA-T)抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)的小鼠为对照,结果表明在实验组与对照组小鼠脑部均未发现[3H]-GABA的存在,从而认定GABA不具备BBB透性。然而,Boonstra等[11]指出,Kuriyama等[44]在实验中使用的[3H]-GABA,因其分子结构上额外附加一个羟基,致使其结构异于GABA原结构。通常,物质结构的变化,会导致其理化特性或生理功能的改变,因而需进一步评估Kuriyam等在实验中所用[3H]-GABA材料对其实验结论的影响。有相关研究[45-48]也指出GABA具备BBB透性。如Li等[48]发现,在对大鼠静脉注入50 mg/kg·bw剂量GABA的60 min后,实验组大鼠脑内GABA浓度(474±33) μg/g显著高于注入生理盐水的对照组(p<0.05),同时注入GABA的大鼠还表现出镇静及困倦的行为效应。此外,Löscher等[49]还以犬为实验对象,进行在体实验发现,经静脉注入犬体内的GABA,还可通过渗透其BCSFB进入脑脊液。

相较体内研究,体外BBB模型具备可控性强、效率高等优点,因而常选择构建适宜的体外BBB模型,用于评估外源物质对BBB的透性。由于人源体外BBB模型的构建,受取材困难等限制,因而在实验中多以鼠、牛等动物脑部为供源,用于构建体外BBB模型[50]。Takanaga等[45]报道,在鼠源永生化细胞体外BBB模型(TM-BBB)中存在一种GABA转移蛋白(BGT-1,slc6a12),该蛋白可实现外源[3H]-GABA对模型细胞的胞内转运。同时作者经RT-PCR及Western blot证实,BGT-1蛋白在鼠脑微血管内皮细胞也具有相同表达,即表明BGT-1蛋白可参与GABA对BBB的透入。此外,Kakee等[46]又以脑外排指数(BEI)和脑摄取指数(BUI)为指标,将[3H]-GABA显微注射到大鼠大脑皮层顶二区,进行在体实验,结果显示[3H]-GABA可透过BBB实现脑组织与血液间的双向转运,并且其外排速率高于摄取速率的16倍。同时,作者也在永生化鼠源脑毛细血管内皮细胞系MBEC4中发现了BGT-1蛋白的表达。Uchida等[51]通过对5份人脑微血管样本所含转运蛋白的分析发现,BGT-1蛋白在人脑微血管中的平均含量为(3.16±0.94)fmol/μg·蛋白。虽然BGT-1(slc6a12)相对其它三种GABA转运蛋白(slc6a1、slc6a11、slc6a13),对GABA的亲和力最低(Km=80 μmol/L),其分布量在脑中也相对较少,但BGT-1在软脑膜处却具有相对高的表达量[52]。而软脑膜处丰富的毛细血管,可与脑室管膜上皮细胞共同形成脉络丛组织,由此或可解释GABA透过BCSFB进入脑脊液的原因。BGT-1等GABA转运蛋白还广泛分布于星形胶质细胞,而作为BBB重要构成部分的星形胶质细胞,其可通过细胞终足,包裹约整个脑毛细血管表面,同时桥连神经元与突触间隙[53-55]。研究[56-57]发现,星形胶质细胞在介导BBB透性、神经元兴奋性和突触传递的同时,还可参与脑与血液间的物质交换以及多种神经递质(如GABA)的合成。由此,血液循环中的GABA可进入中枢神经系统,在结合相应受体后,参与对睡眠活动的改善。

鉴于对活性人脑微血管内皮细胞取材困难限制,对其所含BGT-1蛋白的深入研究,则可基于体外模型予以开展。由于物种差异,任何动物源体外BBB模型,都无法完全模拟在体条件下人BBB功能,而选择构建人源体外BBB模型,更有益于研究外源物质对人BBB的透性。在现已构建的人源体外BBB模型中,以永生化人脑微血管内皮细胞系(hCMEC/D3细胞系)使用最广,但该细胞系的屏障性能易受培养条件影响,在常规培养条件下难以对小分子物质进行有效阻隔[50]。为适应更高要求,因而需要开发构建新的的人源体外BBB模型。近年来,随着干细胞技术的快速发展,现已可实现通过诱导多能干细胞(iPSC),用于人源BBB模型的构建[58]。由于现有人工操作诱导培养技术,难以实现对细胞诱导过程中的生理变化,进行实时动态把控,加之人工操作效率低等问题,制约了干细胞诱导分化的成功率和稳定性。幸运的是,借助我国中科院广州生物医药与健康研究院自主研制的全自动干细胞诱导培养设备,则可实现多能干细胞诱导的全程自动化操作,在有效解决上述问题的同时,持续的为人源BBB模型的构建提供合格的诱导细胞。

3 GABA通过体内代谢物在改善睡眠方面的作用机制

外源摄入的GABA,在机体内可通过GABA旁路(GABA-shunt)进行分解代谢,其代谢产物之一的γ-羟基丁酸(Gamma -hydroxybutyrate,GHB),是一种具备BBB透性的水溶强效中枢镇静剂[59]。研究发现,患有睡眠障碍的个体在外源摄入低剂量的GHB后,能够增加其夜间δ波睡眠、改善睡眠品质[60]。而GHB改善睡眠的作用机制与其作用GABA-B受体以及部分GABA-A亚型受体(如α4β1δ亚型)有关[61-62]。GHB与GABA类似,均以内源物形式分布于机体中,生理状态下,GHB在人血液和脑内的cut-off值分别为4 mg/L和10 mg/kg[63-64]。GHB与GABA在一定条件下,可实现二者间的相互转化。现已证实[65]在琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)缺乏症患者体内,可由GHB转化为GABA,但该转化途径是否同样存在于生理状态下的机体内,仍有待进一步研究。而有实验[62]表明,在对小鼠腹腔注入高剂量GHB(300 mg/kg·bw)后,其脑内的GABA含量并未得以提升,同时作者还通过代谢组学分析发现,分布于肝脏的GHB可分别通过HOT酶或GHB还原酶分解为琥珀酸半醛(SSA),前者产生的SSA被代谢为4,5-二羟基己酸酯(4,5-dihydroxyhexanoate),后者产生的SSA则被氧化为琥珀酸,最后进入三羧酸循环。

当前,仅有少数文献报道,经口摄入的GABA在体内与GHB之间的代谢转化关系。据一项体内研究[41]显示,在灌胃小鼠[14C]-GABA的1h后,其肝脏中[14C]-GABA和SSA的含量达到最高值,而GHB含量在灌胃3 h后才显著升高。其原因可能在于:一部分SSA通过琥珀酸半醛还原酶转变成了GHB;另一部分SSA则氧化成了琥珀酸[66],而当肝细胞中线粒体含有过量的GABA或GHB,且缺乏足够供氧时,经GABA旁路产生的琥珀酸,会提高线粒体基质中总琥珀酸含量,进而促使由琥珀酸辅酶A连接酶催化生成ATP(或GTP)的可逆反应转向逆反应方向进行,从而降低其底物水平磷酸化,由此也在一定程度上间接抑制了肝脏中GHB的分解。综上GABA可通过其体内代谢途径,间接参与睡眠活动的调节。

4 展望

GABA对睡眠障碍的改善功效,可能是基于其多途径作用后的综合效果。GABA作为一种水溶性小分子物质,其弱亲脂性特点,限制了自身难以迅速透过血脑屏障,而需借助相关转运蛋白(如BGT-1蛋白),透入脑组织。由于BGT-1蛋白对GABA的亲和力较弱,当血液中GABA浓度过低时,其可能难以实现对脑组织的有效透入。前文所述,在人脑部血液和脑组织间,还可通过其他途径进行物质交换,因而在后续研究中,可就机体血液中GABA含量水平及其脑组织透入方式与改善睡眠间的联系进行深入探讨。下丘脑视交叉上核(SCN)被视为哺乳动物的昼夜节律起搏器,而分布于不同SCN神经元的GABA能够参与维持昼夜节律协调[67]。因此外源摄入GABA后,对睡眠障碍患者昼夜节律的影响,可能也是GABA对改善睡眠作用的潜在方式。

肠-脑轴是机体肠道和大脑间一个复杂的信息双向交流系统,胃肠道是经口摄入GABA体内吸收的重要部位,因而GABA通过肠-脑轴,上行作用中枢神经系统,是其发挥睡眠改善作用的有效途径,但两者间深入的内在联系还需进一步研究。研究显示,宿主肠道微生物与其肠-脑轴间也存在着交互作用,而人体胃肠道中分布的微生物,其总数可达100万亿、种类近1000种[68]。近年来,持续的研究发现,肠道微生物的丰度及代谢活动对宿主胃肠道功能失衡、抑郁、焦虑和失眠等疾病的发生发展或预防治疗具有重要影响[69]。有文献[70]报道,GABA可作为生长因子,调控宿主肠道微生物的生长(如KLE1738菌),由于人体胃肠道中尚有23%～65%的物种仍未培养,因而GABA对这些微生物的生长代谢及其生物学功能的影响尚有待进一步揭示。