使用GEO数据集分析驱动蛋白KIF2C在膀胱癌中的表达及临床意义

冯雨嘉，蒋佳志，晏 鑫，郭梓鑫，李 胜，孟详喻，陈 松

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，且发病率呈现逐年增长趋势[1]。尽管治疗手段多样且不断改进，但复发率仍较高，尤其肌层膀胱癌和转移性膀胱癌的预后更差，近十年治疗未取得重要进展[2]。

驱动蛋白家族成员2C(kinesin family member 2C，KIF2C)，也叫分裂着丝粒相关驱动蛋白(mitotic centromere associated kinesin,MCAK)，是驱动蛋白家族-13中最具代表性的成员，参与微管的解聚、二极纺锤体的形成和染色体的分离，从而对有丝分裂和细胞周期进行调节。KIF2C可以使细胞间期中微管的稳定性降低，抑制KIF2C可以导致多种动点-微管附着缺陷，动点-微管的连接异常可以导致非整倍染色体细胞的产生。此外，KIF2C表达水平的降低或缺失将导致有丝分裂S期染色体的排列异常和G2期染色体的错误分离，从而破坏正常的有丝分裂进程，这些都被认为是诱发肿瘤的潜在原因[3]。但是，KIF2C基因在膀胱癌中的表达研究报道较少。

本研究通过收集美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表达汇编(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库的公共数据集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析KIF2C在膀胱癌中的表达情况，探究KIF2C与膀胱癌预后的关系，并使用基因集富集分析(gene sets enrichment analysis,GSEA)的方法预测在膀胱癌细胞中可能受KIF2C调控的基因集，为进一步研究KIF2C在肿瘤发生发展中的作用机制提供线索和思路。

1 资料和方法

1.1 资料 从GEO数据库中下载基因表达谱数据集，选取标准为包含KIF2C表达数据的人类膀胱癌和正常膀胱组织的表达谱。数据集GSE13507[4]使用Illumina公司的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip基因表达芯片，该数据集包含了165例原发性膀胱癌和10例正常膀胱组织的基因表达谱及性别、年龄、TNM分期等临床信息。在GSE13507数据集中筛选了膀胱癌患者和正常膀胱组织的KIF2C基因表达谱数据及相应的临床信息。使用GSE13507数据集用于GSEA分析。在数据集GSE13507中，KIF2C基因对应的探针为ILMN_1685916。

1.2 方法

1.2.1 数据分组 对样本数据集GSE13507做回顾性研究和生存期分析，排除其中临床资料缺失的样本，根据表达谱数据对样本的KIF2C的表达进行由高到低排序后，取前50%的样本为高表达组(n=82)，后50%的样本为低表达组(n=83)。

1.2.2 挖掘样本富集基因 采用GSEA3.0版本[5]进行分析。GSE13507被纳入GSEA。膀胱癌组织样本根据KIF2C的表达水平被分为高表达组和低表达组后，通过GSEA分析KIF2C的表达水平对各种生物通路基因集的影响。GSEA网站的MsigDB数据库中获得的基因集作为参照基因集，按照默认加权富集统计(GSEA说明详见http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)的方法，每次随机重复1 000次进行分析。

1.2.3 统计学处理及作图 统计学处理以及作图分别使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5软件。使用两独立样本t检验的方法进行膀胱癌细胞与正常膀胱组织细胞中基因表达差异的比较。临床病理相关性分析中，组间比较采用联列表法和χ2检验。进行生存分析时，使用Log-rank(Mantel-Cox)法比较KIF2C高表达与低表达组的生存期，以P<0.05为差异比较有统计学意义。在GSEA中，P<0.05及错误发现率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作为显著富集基因集。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和正常膀胱组织中KIF2C的表达 在膀胱癌样本数据集GSE13507中，KIF2C在正常膀胱组织中低表达(7.390±0.043，n=10)，在膀胱癌组织中高表达(8.959±0.086，n=165)，比较差异有统计学意义(P≤0.000 1，图1)。

图1 膀胱癌组织和正常膀胱组织中KIF2C的表达

2.2 KIF2C表达水平与膀胱癌的临床病理相关性 在膀胱癌样本数据集GSE13507中，疾病是否进展(P=0.009)、疾病分级(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.013)与KIF2C的表达差异比较有统计学意义；M分期与KIF2C的表达差异比较无统计学意义(P=0.687，表1)。

2.3 KIF2C与膀胱癌患者的预后相关性 在膀胱癌样本数据集GSE13507中，KIF2C高表达组和低表达组的5年肿瘤特异性生存率分别为67.986%和92.203%(Log-rank=13.030，P=0.0003，HR=0.2743，95%CI：0.1359～0.5537，图2A)；5年总生存率分别为50.969%和70.538%(Log-rank=9.217，P=0.0024，HR=0.4700，95%CI：0.2887～0.7652，图2B)。

2.4 KIF2C高表达的基因集富集 用GSEA方法分析KIF2C的表达水平对各种生物通路基因集的影响，使用基因集“oncogenic gene sets”作为参照基因集，GSEA的结果显示KIF2C高表达的样本富集了与核糖体蛋白质、多梳蛋白、内源性核糖核酸酶、E2F转录因子、抑癌基因RB有关的基因集(表2)。

表1 KIF2C表达水平与膀胱癌的临床病理相关性

注：N分期KIF2C高表达组有1例数据删失

图2 膀胱癌患者生存曲线

基因集富集分数FDRP值RPS14dn.v1dn-0.75120.0128<0.0001PRC2EZH2up.v1up-0.70420.0092<0.0001E2F1up.v1up-0.70140.0089<0.0001E2F3up.v1up-0.69210.0114<0.0001CSRlateup.v1up-0.73270.0108<0.0001Rbp130dn.v1up-0.64000.01130.0020GCNPSHHupearly.v1up-0.68550.02460.0021

3 讨论

驱动蛋白包括一个巨大的马达蛋白超家族，它最初是1985年在鱿鱼神经细胞大轴突内部发现的，主要存在于真核细胞内。驱动蛋白在有丝分裂中起着重要作用，这启发人们思考通过抑制驱动蛋白的生物学功能来抑制肿瘤的生长，以此作为治疗癌症的手段。通过破坏驱动蛋白的轨道—微管蛋白[6]，可以有效的对癌症进行控制和治疗。目前微管蛋白抑制剂(microtubule inhibitor,MTI)已经可以成功地抑制有丝分裂，达到阻碍癌细胞增殖的效果。

KIF2C/MCAK(染色体1p34)是驱动蛋白家族中最具特征的成员[7]，以往的研究表明KIF2C对纺锤体组装和确保有丝分裂过程中染色体的分离起着重要作用[8-10]，KIF2C的过表达可以抑制染色体不稳定的细胞系中细胞染色体的分离错误[11]。在有丝分裂过程中，KIF2C还在维持遗传完整性方面起着重要的作用。有研究表明KIF2C基因的表达水平与增殖细胞核抗原(Ki-67)密切相关[12]，Ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白质，是目前多种恶性肿瘤研究中的热门生物指标，可以通过Ki-67抗原的检测了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。多项恶性肿瘤研究表明，KIF2C过表达可能与乳腺癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤的进展有关[13-16]，这可能与非整倍体的形成有关[17]。

本研究发现KIF2C在膀胱癌组织中较正常膀胱组织表达上调，提示KIF2C的表达与膀胱癌的发生发展有关。类似的结果在结直肠癌、胃癌、胰腺癌、头颈癌和乳腺癌中也有发现。Gnjatic等[16]研究显示，KIF2C在结肠癌细胞系和结直肠癌患者的恶性组织中表达上调，在胃癌、胰腺癌、头颈癌和乳腺癌中均有表达上调，并发现KIF2C可能是多种癌症主动免疫治疗的靶点之一。Duan等[18]研究表明，肿瘤组织中的KIF2C表达有望作为男性食管鳞状上皮细胞癌患者的独立预后标志。Shimo等[14]研究表明，KIF2C在乳腺癌组织中高表达，并且可能在乳腺癌细胞的细胞分裂中扮演重要的角色，此研究还通过cDNA微阵列数据发现了在胰腺癌和膀胱癌中，KIF2C/MCAK都有表达上调，提示KIF2C高表达组膀胱癌患者的临床病理特征(如疾病进展，肿瘤分级，T分期，N分期)明显差于KIF2C低表达组的患者，说明KIF2C的高表达与膀胱癌的恶性程度及疾病进展密切相关。GESA分析揭示其机制可能是，高表达KIF2C通过调节细胞周期(内源性核糖核酸酶、E2F转录因子)、细胞增殖(多梳蛋白、抑癌基因RB)和细胞蛋白质合成(核糖体蛋白质)相关的基因集，影响膀胱癌细胞的增殖和代谢进而推动膀胱癌的发生发展。此外，本研究生存期分析提示KIF2C高表达的患者术后生存期更短、复发更快，KIF2C有望成为评估膀胱癌预后的标志物之一。本研究的局限性和启示：①由于数据集样本量的限制，未来实验研究需扩大样本量、严格分组来进一步验证；②KIF2C调控这些信号通路的作用机制还不十分清楚，是否为膀胱癌患者临床预后的独立危险因素，还有待更深入的机制研究加以验证。

综上所述，KIF2C可通过多种途径来促进膀胱癌细胞的增殖和分裂，进而影响膀胱癌患者的临床预后。因此，KIF2C有希望成为诊断膀胱癌的标志物或潜在治疗靶点，这为未来的临床研究提供了新的思路。