川白獭兔兔肉肌原纤维蛋白热诱导凝胶制备工艺优化

陈炼红,王琳琳,简文素2,汪 平2,张 岩

(1.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041; 2.四川省草原科学研究院,四川新津 611430)

川白獭兔是以德系獭兔与美系獭兔为育种素材,经过近13年选育而成的具有生长速度快、体型大、被毛密度好、枪毛比例低等生产性能突出的獭兔新品种,也是我国第一个自主培育的獭兔新品种,目前已在我国多省市累计推广11.30万只,改良獭兔27万只,经济社会效益较好,深受养殖户和社会的广泛认可[1]。川白獭兔肉具有肌纤维细嫩,易于消化吸收,蛋白质含量高、脂肪含量低等优点[2]。随着消费市场对獭兔皮毛需求量的日益增大,獭兔的养殖规模也在逐渐扩大。但是,现阶段对獭兔的研究和利用主要集中在其皮毛上,而关于獭兔肉加工利用的相关研究报道不足[3]。因此,对川白獭兔肉加工特性进行研究,有利于提高獭兔肉的综合加工与利用。

肌肉肌原纤维蛋白在肉品蛋白质凝胶过程中起着极其重要的作用,且其形成凝胶的能力均高于其他动植物蛋白质[4]。在肉制品生产加工过程中,肌原纤维蛋白的热诱导凝胶特性是最重要的功能特性之一,对于提高肉制品的加工性能具有重要意义[5-6]。在肌原纤维蛋白凝胶特性相关报道中,研究主要集中在通过改变外源非肉蛋白种类、肌原纤维蛋白浓度、离子强度、pH、肌肉种类、外源物质、加热方式等,探索上述因素对凝胶产品的质构、持水性、乳化性及流变学等特性的影响,从而达到改变肉制品功能特性的目的[7-10]。崔旭海等[11]研究发现添加不同种类的分离蛋白对鲤鱼鱼糜凝胶特性影响较大。Bertram等[12]和Chantrapornchai等[13]研究均指出离子强度的增加有利于提高蛋白凝胶的持水性。同时,热诱导温度也对肌肉蛋白的凝胶特性具有重要影响,过高或者过低的热处理温度均不利于凝胶的形成[14]。目前,有关肌肉蛋白热诱导凝胶特性的研究主要集中在猪肉[5-6]、羊肉[7]、鸡肉[10]、鱼肉[11]、白兔肉[13]和鸭肉[14]等原料肉,而在獭兔肉肌肉蛋白凝胶特性方面还尚未见报道。因此,有必要对獭兔肉肌原纤维蛋白的凝胶特性进行研究与探讨。

本研究以獭兔肉背最长肌为试验材料,探究大豆分离蛋白添加量、肌原纤维蛋白浓度、离子强度和pH等因素对獭兔肉肌原纤维蛋白凝胶质构特性和持水性的影响;通过单因素和响应面试验,确定獭兔肉肌原纤维蛋白凝胶特性的影响因素及最佳诱导条件,以期为獭兔肉的加工利用提供理论支持和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

随机选取相同饲养环境条件下的150日龄白色獭兔 采自四川草科院獭兔所自主培育的白色獭兔品系共20只(公母各半),宰后立即取背最长肌作为试验材料,将所有肉样用自封袋包装并冷藏带回实验室,置于-18 ℃条件下冻藏待测;磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸氢二钾、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇(DTT)、叠氮化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、磷酸、乙醇、氢氧化钠 均为分析纯,购自成都市科龙化工试剂厂。

PL303电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;TD4A台式离心机 长沙英豪仪器有限公司;UV-2102C/PC/PCS紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;TA-XT plus质构仪 英国Stable Micro System公司;Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;FSH-2A可调高速组织匀浆机 金坛市华城海龙实验仪器厂;MP511 Lab pH计 上海三信仪表厂。

1.2 实验方法

1.2.1 肌原纤维蛋白提取 参照Xiong等[15]的方法并作改进。将肉样进行空气解冻,去除结缔组织和脂肪组织并制成肉糜,取28.5 g肉样,加入250 mL分离缓冲液A(50 mmol/L K2HPO4,100 mmol/L KH2PO4,0.1 mol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L DTT,1 mmol/L 乙二醇二乙醚二胺四乙酸,pH7.0),匀浆2 min,并在4 ℃、5500 r/min条件下离心10 min,取沉淀,重复以上离心步骤3次后所得沉淀即为粗肌原纤维蛋白。进一步纯化,加入100 mL分离缓冲液B(1 mmol/L NaN3,0.1 mol/L NaCl,pH6.25),充分溶解后,在4 ℃、5500 r/min条件下离心10 min,取沉淀,重复以上离心步骤3次后所得沉淀即肌原纤维蛋白。采用考马斯亮蓝G-250法测定所提取的肌原纤维蛋白的浓度[16]。

1.2.2 肌原纤维蛋白凝胶的制备 参考文献[17-18]方法。采用线性升温方法,吸取15 mL搅拌均匀的肌原纤维蛋白溶液置于直径25 mm离心管中,用水浴加热方式以2 ℃/min的速度从25 ℃线性升温至80 ℃,恒温保持20 min后取出,快速冷却至4 ℃,待测。测定前需将凝胶置于室温下平衡1 h,用于凝胶特性的测定。

1.2.3 单因素试验设计 选取大豆分离蛋白添加量、肌原纤维蛋白浓度、离子强度和pH对肌原纤维蛋白凝胶特性硬度、弹性和持水性的影响进行研究。

1.2.3.1 大豆分离蛋白添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 将45 mg/mL的肌原纤维蛋白分别加入到大豆分离蛋白含量(2%、4%、6%、8%、10%)的烧杯中,并用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH6.5)将混合蛋白溶液浓度调至40 mg/mL,研究大豆分离蛋白添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性硬度、弹性和持水性的影响。

1.2.3.2 肌原纤维蛋白浓度对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 将肌原纤维蛋白稀释到含量为35、40、45、50、55 mg/mL,然后,分别加入到含6%大豆分离蛋白的烧杯中,并用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH6.5)将混合蛋白溶液浓度调至40 mg/mL,研究肌原纤维蛋白浓度对肌原纤维蛋白凝胶特性硬度、弹性和持水性的影响。

1.2.3.3 离子强度对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 将45 mg/mL的肌原纤维蛋白加入到含6%大豆分离蛋白的烧杯中,并分别用50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,NaCl溶液(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L),pH6.5的磷酸盐缓冲液将混合蛋白溶液浓度调至40 mg/mL,研究离子强度对肌原纤维蛋白凝胶特性硬度、弹性和持水性的影响。

1.2.3.4 pH对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 将45 mg/mL的肌原纤维蛋白加入到含6%大豆分离蛋白的烧杯中,并分别用50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的1.2.3.1磷酸盐缓冲液将混合蛋白溶液浓度调至40 mg/mL,研究pH对肌原纤维蛋白凝胶特性硬度、弹性和持水性的影响。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上,选取大豆分离蛋白添加量、肌原纤维蛋白浓度、离子强度和pH 4个因素为变量,以凝胶的硬度、弹性和持水性为响应值,应用Design-Expert 8.0 软件,设计四因素三水平的响应面分析试验设计。响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.2.5 测定指标

1.2.5.1 凝胶硬度和弹性的测定 将凝胶样品制成20 mm厚度,直径为25 mm的圆柱体,在室温下利用质构仪对肌原纤维蛋白凝胶的硬度和弹性进行测定[19]。探头类型P/0.5,参数设置:测前速度1.0 mm/s,测定速度0.5 mm/s,测后速度1.0 mm/s,压缩距离5.0 mm。触发类型:自动,时间5 s,触发力5.0 g。

1.2.5.2 凝胶持水性的测定 取5 g于4 ℃条件下保藏24 h的凝胶,精确称重(M1),移至50 mL离心管中称重(M2),并于5500 r/min条件下离心15 min。弃上清液后称重(M3)[20-21]。

凝胶持水性=(M3-M2+M1)/M1

1.3 数据处理

所有数据均为三次重复测定的平均值,结果用平均值±标准差表示。采用Microsoft 2016 Excel进行整理,并用SPSS 19.0和Design Expert 8.0软件进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 大豆分离蛋白添加量对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 由图1可知,随着大豆分离蛋白添加量的增加,凝胶的硬度、弹性及持水性均呈先上升后下降的趋势;当大豆分离蛋白添加量为6%时,凝胶的硬度、弹性及持水性均显著高于其他添加量(P<0.05),原因可能是大豆分离蛋白除具有热凝固性和纤维形成性的优良性状外还有凝胶化特性,加热后会增加凝胶强度,但过量添加会造成固形物过多,产生凝结现象导致凝胶品质下降,此结果与罗通彪[22]研究结果一致。张志芳等[14]研究也证实大豆分离蛋白的添加有助于提高肌原纤维蛋白凝胶的硬度、弹性和持水性,与本研究结果一致,本研究所选大豆分离蛋白的添加量为6%。

图1 大豆分离蛋白添加量对凝胶硬度、 弹性和持水性的影响Fig.1 Effect of soybean protein isolate addition on gel hardness,resilience and water-holding capacity注:同一指标不同小写字母表示 差异显著(P<0.05),图2～图4同。

2.1.2 肌原纤维蛋白浓度对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 图2表征了肌原纤维蛋白浓度对獭兔肉肌原纤维蛋白凝胶硬度、弹性和持水性的影响。

图2 肌原纤维蛋白浓度对凝胶硬度、弹性和持水性的影响Fig.2 Effect of myofibrillar protein concentration on gel hardness,resilience and water-holding capacity

2.1.3 离子强度对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 由图3可知,蛋白热诱导凝胶的硬度、弹性随着离子强度的增加整体呈先增大后减小的变化趋势,在离子强度为0.7 mol/L时达到最大值;而凝胶持水性随着离子强度增加变化不显著(P>0.05)。离子强度也能通过影响肌原纤维蛋白的溶解进而对凝胶的持水性产生作用;同时,在一定范围内,随着离子强度的提高,凝胶的硬度、弹性和持水性均呈上升趋势,但当离子强度高于0.7 mol/L时,硬度减小而弹性趋于稳定,可能是肌原纤维蛋白的溶解度到达临界值的原因,故本研究所选的离子强度为0.7 mol/L。

图3 离子强度对凝胶硬度、弹性和持水性的影响Fig.3 Effect of ion concentration on gel hardness, resilience and water-holding capacity

2.1.4 pH对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响 由图4可看出,pH对肌原纤维蛋白凝胶的硬度、弹性和持水性均有一定影响。其中,凝胶硬度和弹性均随凝胶形成环境pH的升高呈先增大后减小的变化趋势,当pH为7.0,硬度和弹性均达到最大值并显著高于其他pH处理组(P<0.05),原因是当pH接近等电点范围时,蛋白质分子间疏水作用增强,蛋白溶解度部分或全部丧失,蛋白质分子无序聚集,形成容易渗水且强度较弱的凝胶,引起凝胶硬度和弹性下降[23];凝胶持水性随pH增大呈缓慢上升趋势,但差异不显著(P>0.05),可能是因为较高的pH有利于蛋白之间静电斥力和蛋白-水作用的增强,本研究所选的pH为7.0。

表2 肌原纤维蛋白凝胶响应面试验结果Table 2 Response surface design and results of protein gel

图4 pH对凝胶硬度、弹性和持水性的影响Fig.4 Effect of pH on gel hardness,resilience and water-holding capacity

2.2 响应面优化獭兔肉肌原纤维蛋白凝胶诱导条件优化

2.2.1 响应面优化试验结果与分析 根据单因素试验结果,以大豆分离蛋白添加量(A)、肌原纤维蛋白浓度(B)、离子强度(C)和pH(D)为试验因子,以凝胶硬度(Y1)、弹性(Y2)和持水性(Y3)为响应值,依据Box-Behnken原理进行响应面试验设计,试验优化结果见表2。

续表

表3 硬度拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with hardness

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

2.2.2 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶硬度的响应面分析试验

2.2.2.1 模型方程的建立与方差分析 通过Design-Expert软件对凝胶硬度进行回归分析,得到如下回归方程:

Y1=-6927.33+789.37A+52.63B+11589.05C-45.265D-2.94AB-362.30AC+21.96AD-1.03BC+7.92BD+799CD-44.83A2-0.86B2-11187C2-74.57D2

在凝胶硬度回归模型中,一次项B(P=0.0042)、C(P<0.0001)对方程影响极显著(P<0.01),交互项AC(P=0.0472)、BD(P=0.0322)和CD(P=0.0309)均对方程影响显著(P<0.05),二次项A2(P<0.0001)、B2(P=0.0052)、C2(P=0.0008)对方程影响极显著(P<0.01),D2(P=0.0128)影响显著(P<0.05),所得各自变量对凝胶硬度的影响程度大小顺序为:C>B>A>D。

由表3可以看出，大部分情况下，换相失败判断结果与PSCAD运行结果一致，通过本文提出的方法能准确判断是否发生换相失败。但如表3中AB两相经20 Ω电阻相间短路，即将发生或避免发生换相失败时，出现了判断结果与实际结果不一致的情况，此时换流器两侧谐波含量较大，判断换相失败与否需要计及交流侧三次谐波和直流侧二次谐波，此时对各换流阀实际触发角、换相角、熄弧角进行分析。

2.2.2.2 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶硬度的响应曲面分析 响应面反应两个变量之间交互作用,以及每个变量水平对响应值的影响程度[24],由此可知各试验变量间的交互作用对凝胶硬度、弹性和持水性的影响。其中,响应曲面越陡表征该变量对响应值的影响作用越大;响应曲面越平缓表征该变量对响应值的影响越小[25]。

图5 各因素交互作用对肌原纤维蛋白凝胶硬度显著影响的响应面Fig.5 Response surface of the interactive effects of factors on the gel hardness

如图5a～图5c所示,大豆分离蛋白添加量和离子强度、蛋白浓度和pH以及离子强度和pH之等两两之间的交互作用均对凝胶硬度有显著影响,其他交互项均无显著影响(文中未列出)。凝胶硬度随大豆分离蛋白添加量增加呈上升趋势且响应曲面的坡面逐渐变陡,原因可能是大豆分离蛋白的凝胶性可以将蛋白溶胶基质“固化”形成具有一定机械强度的网状结构,有效提高了肌原纤维蛋白凝胶的硬度,从而防止已形成的乳化肉糜在加热过程中被破坏[26]。但随着离子强度的增强,硬度呈先上升后下降的变化,当离子强度为0.70 mol/L左右时,凝胶硬度最好,说明离子强度对肌原纤维蛋白凝胶的硬度具有较大影响,离子强度主要通过影响分子的聚集行为和聚集体的大小对凝胶特性造成影响[27],过高或过低的离子强度均不利于凝胶网状结构的形成和稳定,本研究与Bertram等[12]研究一致。同时,肌原纤维蛋白浓度与pH之间的交互作用对凝胶硬度也有显著影响,凝胶硬度随蛋白浓度和pH增加整体呈先上升后下降的变化趋势,当pH为6.80以及蛋白浓度为51.0 mg/mL左右时,凝胶的硬度最好;且离子浓度与pH之间的交互作用也对凝胶硬度有显著影响,随着pH的增大,凝胶硬度呈显著上升变化,但随着离子强度的增大,凝胶硬度呈下降趋势且响应曲面逐渐变陡。

表4 弹性拟合二次多项式模型方差分析Table 4 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with resilience

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

2.2.3 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶弹性的响应面分析试验

2.2.3.1 模型方程的建立与显著性检验 通过Design-Expert软件对凝胶弹性进行回归分析,得到如下回归方程:

Y2=-9.59+0.29A+0.11B+10.19C+0.79D+8.00E-004AB+0.055AC+0.025AD-0.035BC-5.00E-003BD+1.41CD-0.04A2-5.41E-004B2-13.61C2-0.12D2

表5 持水性拟合二次多项式模型的方差分析Table 5 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with water-holding capacity

注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

在凝胶弹性回归模型中,一次项A(P=0.0062)对方程影响极显著(P<0.01),C(P<0.0401)对方程影响显著(P<0.05),交互项CD(P=0.0450)对方程影响显著(P<0.05),二次项A2(P=0.0043)对方程影响极显著(P<0.01),C2(P=0.0171)和D2(P=0.0316)对方程影响显著(P<0.05),所得各自变量对凝胶弹性的影响程度大小顺序为:A>C>B>D。

2.2.3.2 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶弹性的响应曲面分析 由图6,交互项蛋白浓度和离子强度之间的相互作用对凝胶弹性有显著影响,其他交互项均无显著影响(文中未列出)。分析CD交互影响的响应面图可知,离子强度与pH的交互作用较强,随着离子强度和pH的增大凝胶弹性呈先上升后下降的变化趋势,且响应曲面的坡面逐渐变陡,当离子强度为0.65～0.70 mol/L,pH在6.5～7.0范围内时,凝胶具有较好的弹性。pH主要通过影响蛋白体系静电荷的数量,蛋白表面的静电荷越多,静电斥力越大,所形成的凝胶为线性聚集体结构,较不稳定[28]。

图6 pH和离子强度交互作用对肌原纤维蛋白 凝胶弹性影响的响应面Fig.6 Response surface of the interactive effects of pH and ion concentration on resilience

2.2.4 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶持水性的响应面分析试验

2.2.4.1 模型方程的建立与显著性检验 通过Design-Expert软件对凝胶持水性进行回归分析,得到如下回归方程:

Y3=-8.43+0.30A+0.11B+9.04C+0.76D-6.45E-004AB-0.0685AC+0.01AD+0.03BC-6.58E-003BD+0.02CD-0.023A2-7.6517E-004B2-7.59C2-0.036D2

在凝胶持水性回归模型中,一次项A(P<0.0001)、C(P=0.0024)对方程影响极显著(P<0.01),B(P=0.0446)对方程影响显著(P<0.05),BD(P=0.0107)对方程影响显著(P<0.05),二次项A2(P=0.0001)、B2(P=0.0007)和C2(P=0.0007)也均对方程影响极显著(P<0.01),所得各自变量对凝胶硬度的影响程度大小顺序为:A>C>B>D。

2.2.4.2 各因素对肌原纤维蛋白热诱导凝胶持水性的响应曲面分析 如图7,交互项蛋白浓度和离子强度之间的相互作用对凝胶持水性有显著影响,其他交互项均无显著影响(文中未列出)。分析BD交互影响的响应面图可知,随着肌原纤维蛋白浓度和pH的增大,凝胶持水性呈上升的变化趋势且响应曲面的坡面逐渐变陡,主要因为pH的增大,导致蛋白体系内蛋白所含静电荷增加,静电斥增大,蛋白质结合水的能力也随之增强,进而导致持水性的增强。同时,随着肌原纤维蛋白浓度的增大,凝胶的持水性也逐渐增大,原因是溶解的蛋白质含量的增多,有利于高密度蛋白形成紧密且稳定的立体网状结构,说明蛋白浓度的增加有利于提高凝胶的持水性。

图7 pH和蛋白浓度交互作用对肌原纤维蛋白 凝胶持水性影响的响应面Fig.7 Response surface of the interactive effects of pH and protein concentration on the water-holding capacity

2.3 獭兔肌原纤维蛋白热诱导凝胶最佳制备条件的预测及验证

响应面图形分别是由大豆分离蛋白添加量、肌原纤维蛋白浓度、离子强度和pH等因子之间的交互作用对凝胶硬度、弹性和持水性等响应值的影响程度构成的三维网络结构图,对回归方程进行求解,可预测得到最优的凝胶硬度、弹性和持水性数值,当大豆分离蛋白添加量为6.28%、肌原纤维蛋白浓度为51.22 mg/mL、离子强度为0.67 mol/L、pH为6.87时,肌原纤维蛋白获得最佳的凝胶特性,此时最大硬度值为508.44 g、弹性为0.35、持水性为0.91。为了比较实际测定值和预测值之间的准确性,考虑到实际工作的可操作性,将最优的预测实验条件进行修正并对模型进行实际验证。确定肌原纤维蛋白凝胶最佳制备条件为:大豆分离蛋白添加量6.30%、肌原纤维蛋白浓度51.0 mg/mL、离子强度0.67 mol/L、pH6.85。在此参数下制得的凝胶特性指标为:硬度508.435 g、弹性0.337、持水性0.896,与理论值的相对误差分别为0.70%、3.44%、1.58%。说明回归方程能较真实地反应各因素对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响,用响应面法优化獭兔肌原纤维蛋白凝胶最佳诱导工艺所制凝胶特性较好。

3 结论

采用水浴加热线性升温法制备肌原纤维蛋白凝胶,在单因素试验基础之上,以凝胶硬度、弹性和持水性为响应值,建立了评价獭兔肉肌原纤维蛋白凝胶特性的二次多项式模型。结果证明利用响应面确定的该模型是合理的,能用来较好地预测肌原纤维蛋白的凝胶特性。

通过模型分析和实验修正后得到肌原纤维蛋白热诱导凝胶最佳工艺条件为:大豆分离蛋白添加量6.30%、肌原纤维蛋白浓度51.0 mg/mL、离子强度0.67 mol/L、pH6.85,所得凝胶特性指标硬度为508.435 g、弹性为0.337、持水性为0.896。在此最佳工艺条件下的响应值与模型预测值相比,相对误差分别为硬度0.70%、弹性3.44%、持水性1.58%,说明本研究方法所制凝胶品质较好。