多序列比对在克隆表达一株未知芽孢杆菌角蛋白酶基因中的应用

蒋少龙,郭依依,蔡 俊

(湖北工业大学,发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心, 工业微生物湖北省重点实验室,湖北武汉 430068)

角蛋白酶是一种底物非常广的蛋白酶,如胶原蛋白、纤维蛋白、牛乳清蛋白、血红蛋白、酪蛋白等,同时还能够高效降解天然的角蛋白,并且作用条件温和,是一种降解利用角蛋白的绿色方式[1]。不仅如此,角蛋白酶还被发现能够降解顽固的朊病毒,使得角蛋白酶成为目前的研究热点之一[2]。

产角蛋白酶的微生物多种多样,包括细菌、放线菌和真菌都有着大量产角蛋白酶的群体[3-5],同一个属的微生物由于亲缘关系接近,其产生的角蛋白酶序列在进行多序列比对时也发现了明显的亲缘关系,而利用这种亲缘关系可以设计出扩增这些角蛋白酶的简并引物,然后再对这些角蛋白酶基因进行基因工程研究。序列比对是生物信息学研究的重要方法之一,它通过对DNA和蛋白质序列进行相似性比较,直观地显示序列间的保守区域和不同之处,分析基因进化关系[6-7],是设计简并引物前必不可少的分析步骤。

本实验室保藏有一株能够在以羽毛粉为唯一碳氮源的培养基上生长的芽孢杆菌CDJYB(16S rRNA比对结果显示其为芽孢杆菌属),其于养鸡场附近的泥土中筛选得到,现对芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶基因进行原核表达,但因其种名未知,而无法从NCBI上直接找到编码其角蛋白酶的基因序列。由于不同属物种间亲缘关系较差,序列比对结果差异大,所以通过多序列比对设计兼并引物的方式可能仅限于在同属的微生物中进行,本文通过对芽孢杆菌属来源的角蛋白酶基因进行分类比对,筛选一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,并在大肠杆菌中克隆表达,最后再通过SDS-PAGE分析和酶活测定验证该方法的实用性。

表1 角蛋白酶序列信息Table 1 Keratinase amino acid sequence information

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芽孢菌CDJYB、大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH5α、pET-28a质粒 本实验室保藏;pGM-T、细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司;Taq DNA聚合酶、T4连接酶、琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、限制性内切酶BamHI和XhoI、DNA marker DL2000、DNA marker DL10000 宝日医生物技术有限公司;Gold View I核酸染料、蛋白质marker 赛默飞世尔科技有限公司;氨苄青霉素(Amp)、硫酸卡那霉素(Kana)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺 艾万拓威达优尔国际贸易有限公司;甲叉双丙烯酰胺 西格玛奥德里奇;Tris 索莱宝科技有限公司;酪氨酸 武汉市华顺生物技术有限公司;福林酚试剂 国药集团化学试剂有限公司;底物角蛋白(部分磺化) 梯希爱化成工业发展有限公司;其他常用试剂 国药集团化学试剂有限公司。

AR1140电子分析天平 奥豪斯国际贸易有限公司;ZSD-1270全自动生化培养箱 上海智城分析仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司;数显恒温水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所;DYCP-31BN核酸电泳仪 北京市六一仪器厂;Applied BiosystemsTMPCR热循环仪、Freso高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司;凝胶成像仪、SYNERGY2酶标仪 基因有限公司;蛋白质电泳仪 伯乐生命医学产品有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 肉汤培养基(1 L):取10 g蛋白胨、5 g牛肉膏和5 g NaCl,溶于1 L的水中。

LB培养基(1 L):取5 g酵母粉、10 g胰蛋白胨和5 g NaCl,溶于1 L的水中,制成平板时加入1.5%的琼脂,抗性筛选时加入终浓度为100 g/mL氨苄青霉素(Amp)或者30 g/mL硫酸卡那霉素(Kana)。

1.2.2 利用生物信息学工具设计未知角蛋白酶基因的简并引物

1.2.2.1 多种来源的角蛋白酶序列进化树分析 在NCBI数据库中下载了多个被报道过有着角蛋白酶活性的角蛋白酶序列(半数为芽孢杆菌),17个NCBI序列号分别为:AKN20219.1、ACM47735.1、AGO58466.1、AAY82467.1、AIY62812.1、ACN82379.1、AAU94349.1、ADP00718.1、AEI83225.1、AFG35419.1、ABU96301.1、AAG00492.1、AKR05134.1、APS24128.1、ADP00719.1、C4YSF6.1、P0DJ06.1,其信息如表1,并使用MAGE6软件下的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树[8]。

1.2.2.2 芽孢杆菌来源的角蛋白酶多序列比对 由于是设计芽孢杆菌来源的角蛋白酶基因的简并引物,所以只选择17个序列中芽孢杆菌属来源的角蛋白酶序列进行多序列对比,由Clustalx(其原理基于渐进法,对序列进行相似性比较,注意Clustalx无法打开根目录存在中文的文件)完成比对[26],DNAMAN完成图片输出,软件操作流程为:将序列号列在1个TXT格式文件中→利用NCBI的Batch Entrez功能,将所有角蛋白酶的氨基酸序列全部下载到1个FASTE格式文件中→利用Clustalx打开FASTE格式文件,点击Alignment,Do Complete Alignment,将会生成.dnd和.aln文件→打开DNAMAN,点击File,Open Special,Multiple Alignment,选择本次的.aln文件打开→点击Options设置适当的输出格式,最后点击Output,选择Graphic(EMF)File。并将对比结果结合进化树进行分析序列关系,若某些序列存在,严重影响整体的相似度,需要将这些序列另整合至一个文件里,并进行多序列比对,继续筛选出其中差异较大的序列,此时就可以将角蛋白酶序列进行分组,并且适当利用BLAST来填补每组的序列数目。

1.2.2.3 简并引物的设计 根据对比结果和进化树分析,将获得的芽孢杆菌来源的角蛋白酶序列分类,同时对应的基因序列也需要进行多序列对比验证。选择连续6个或以上氨基酸都相同的区域,且每个氨基酸对应的密码子上三个碱基中至少有两个相同,这些区域将会是用来设计简便引物的候选区域,引物合成由南京金斯瑞完成。

1.2.3 角蛋白酶基因完整序列的PCR扩增

1.2.3.1 芽孢杆菌的培养及其全基因组的提取 将保藏于4 ℃的芽孢杆菌CDJYB菌株接入到肉汤固体培养基上,37 ℃培养24 h,然后转接一环活化了的芽孢杆菌CDJYB到5 mL肉汤液体培养基中,180 r/min培养12 h。并参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒来提取芽孢杆菌CDJYB全基因组。

1.2.3.2 角蛋白酶基因的扩增 简并引物以芽孢杆菌全基因组DNA为模板分别进行PCR,PCR体系(50 μL)含ddH2O 36 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 2 μL,A-F 2 μL,A-R 2 μL,全基因组1 μL,Taq DNA Polyase 2 μL,退火温度A1为45 ℃,A2为50 ℃。PCR产物经过测序后,取中间可信程度高的片段发送到NCBI进行BLAST,得到一个相似度100%的完整的角蛋白酶基因,设计不含自身信号肽的引物,以芽孢杆菌全基因组DNA为模板,扩增角蛋白酶基因,扩增条件与上面上述基本一致,退火温度为48 ℃。PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳分析,并使用TAKARA的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收,测序由南京金斯瑞公司完成。

1.2.4 角蛋白酶基因的克隆 回收得到的PCR产物利用TA克隆的方式与pGM-T载体连接,采用10 μL连接体系:ddH2O 5 μL,PCR产物2.5 μL,pGM-T 0.5 μL,10×T4DNA ligation buffer 1 μL,T4DNA ligase 1 μL。连接体系混合均匀后,置于16 ℃低温水浴锅过夜。将连接产物利用热激法转化至克隆宿主DH5α,具体操作:将10 μL连接产物加入到50 μL刚解冻的大肠杆菌感受细胞中,轻轻吹打均匀,冰浴处理 30 min,42 ℃热激90 s,接着再冰浴处理2 min,加入250 μL新鲜的LB培养液,置于37 ℃恒温培养箱中复苏1 h,最后将转化混合物均匀的涂布在LB平板(含100 μg/mL的Amp)上。

运用菌落PCR以及质粒双酶切(BamHI和XhoI)来筛选出生长在LB平板(含100 μg/mL的Amp)上的阳性克隆子,具体步骤:挑取白色的菌落接入 LB 培养液中(含100 g/mL的Amp)在 180 r/min,37 ℃的揺床中培养7～9 h,吸取0.5 L的菌液作为模板进行PCR,PCR体系(25 L)含ddH2O 17 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,T7 promoter primer和SP6 promoter primer各1 μL,菌液0.5 μL,Taq DNA Polyase 1 μL,其退火温度50 ℃。使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。接着利用质粒小提试剂盒提取PCR鉴定结果为阳性菌落的培养物的质粒,再将质粒进行双酶切反应,具体操作:取质粒样品5 μL、10×K buffer 1 μL、对应的限制性内切酶BamHI和XhoI各0.5 μL,补充ddH2O至10 μL,将反应体系轻轻吹打均匀后,置于37 ℃恒温培养箱中反应5 h,使用琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

大量提取质粒PGM-T-Ker,并使用BamHI和XhoI对pGM-T-Ker和pET-28a分别进行线性化处理,再利用DNA凝胶提取试剂盒回收带有粘性末端的角蛋白酶片段和线性化后的pET-28a,并使用T4连接酶连接两者,最后将连接产物转化至表达宿主大肠杆菌BL21,运用菌落PCR以及双酶切来筛选LB平板(含30 μg/mL的Kana)上的阳性克隆子,具体的连接转化及筛选方法与上述相似,菌落PCR采用的引物为T7promoter primer和T7terminator primer,退火温度50 ℃。

图1 部分角蛋白酶氨基酸序列分子系统树Fig.1 Molecular phylogenetic tree of partial keratinase amino acid sequences注:数字为置信度,仅显示70%以上的置信度。

1.2.5 重组大肠杆菌BL21(pET-28a-CDJYB)诱导表达及SDS-PAGE分析 挑选重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)单菌落在的LB培养基(含有30 g/mL Kana)中,37 ℃ 180 r/min过夜培养12 h,然后按照1%(v/v)接种到50 mL的LB培养基(含有30 g/mL Kana)中,37 ℃ 180 r/min培养至OD600达到0.4～0.6,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,置于37 ℃下过夜诱导16 h后准备收集菌体,9000 r/min下离心5 min,弃上清液,用5 mL的50 mmol/L pH10.0 Tris-HCl缓冲液重悬菌体,在冰浴条件下超声破碎,超声破碎的程序为:工作2 s,间歇3 s,功率200 W,共99个循环。超声处理后的样品在9000 r/min下离心20 min,收集上清,沉淀使用适量Tris-HCl(pH10.0)重悬并收集,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析,使用大肠杆菌BL21(pET-28a)作为对照组。

1.2.6 不同温度条件下的蛋白表达量的SDS-PAGE分析及酶活测定

1.2.6.1 蛋白表达量的SDS-PAGE分析 由于在37 ℃时,表达产物主要以包涵体的形式存在,通过适当降低温度,使角蛋白酶可溶性表达,本次实验通过设置不同诱导温度来摸索最佳温度条件,分别设置15、20、25、30 ℃四个梯度。取出在-80 ℃下甘油冻存的菌液,先后于 20 ℃和4 ℃解冻,以2%接种量接种至5 mL LB液体培养基(含30 μg/mL的Kana)中培养12 h,再以1%的接种量接种至50 mL的液体培养基中,37 ℃,180 r/min培养至OD600达到0.4～0.6之间,加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG,并将三角瓶分别放置到15、20、25、30 ℃的摇床(温度预先调好)中,180 r/min诱导16 h,收菌后超声处理,离心分别收集上清和沉淀,准备SDS-PAGE分析目的蛋白可溶性表达情况。

表2 酪氨酸福林酚反应表格Table 2 ReactionTable of tyrosine and forin phenol reagent

1.2.6.2 酪氨酸福林酚标准曲线的绘制及角蛋白酶酶活的测定 取5只5 mL的离心管,依次按照表2所示加样,混匀并于40 ℃水浴中显色20 min,以1号为空白,分别吸取200 μL反应样品于96孔板,使用酶标仪在680 nm下检测吸收光。

酶活测定方法:此方法参考自蒋彪等[27]并结合国标法(GB/T23527-2009)加以改进,取不同温度下诱导的粗酶液1 mL于5 mL离心管中,加入1 mL的1%(w/v)角蛋白底物(5%的角蛋白用50 mmol/L pH10的Tris-HCl稀释),50 ℃水浴20 min,2 mL的0.4 mol/L的TCA终止反应,9000 r/min,离心10 min,取上清1 mL,加入4 mL的0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL的福林酚试剂,40 ℃水浴显色20 min,取反应液200 μL于96孔板用酶标仪在680 nm下检测吸收光,对照组在加入底物前加入TCA。

酶活定义:50 ℃和pH10的条件下,1 min内每释放1 μg的酪氨酸为一个酶活单位。

1.3 数据处理

实验中每个样品重复三次,实验数据表示为Mean±SD,分别采用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2013对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 角蛋白酶序列的系统进化树

如图1,由进化树分析可以知道芽孢杆菌属来源的角蛋白酶都集中在一个簇里面,但是Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis来源的角蛋白酶聚在一起,似乎与其他芽孢杆菌来源的角蛋白酶存在些许进化差异,为了简并引物设计的准确性,需要进一步用多序列比对来检验相似度。

2.2 角蛋白酶序列多序列比对

多序列比对结果如图2,发现当Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis来源的角蛋白酶存在时,严重影响了整体相似度,且Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis来源的角蛋白酶之间却存在较高的相似度,所以决定将收集到的芽孢杆菌来源的角蛋白酶序列分为两类,并分别设计一套简并引物,确保能够准确定位未知芽孢杆菌中的角蛋白酶基因。

图2 部分芽孢杆菌来源的角蛋白酶氨基酸序列比对结果Fig.2 Alignment algorithm of keratinase amino acid sequences from partial Bacillus

表3 简并引物信息Table 3 The information of degenerate primer

2.3 简并引物的设计

简并引物设计序列见表3,将AAY82467.1[Bacilluslicheniformis]、ACM47735.1[Bacilluspumilus]、AGO58466.1[Brevibacillusbrevis]、AIY62812.1[Bacillussubtilis]、AKN20219.1[Bacillustequilensis]、AKR05134.1[Bacillusamyloliquefaciens]6种角蛋白酶及其对应的基因序列分别做多序列比对,最终挑选MDVINMS、PHVAGAA作为引物设计的保守区,并设计第一对简并引物A1-F:5′-ATGGAYGTYATYAAYATGAGC-3′,A1-R:5′-GCYGCTCCBGCWACRTGMGG-3′,能够扩增得到大小为338 bp的片段。

将APS24128.1[Bacillusthuringiensis]和AEI83225.1[Bacilluscereus]在NCBI数据库里做BLAST,查找出大量的未被发现具有角蛋白酶功能的S8家族肽酶(与前两个角蛋白酶序列相似度在99%或以上),挑选部分肽酶序列(WP_098524071.1[Bacillusanthracis]、WP_044584435.1[Bacillusbombysepticus]、WP_098803463.1[Bacillustoyonensis]、WP_060488697.1[Bacilluswiedmannii]、AJI16229.1[Bacilluspseudomycoides]),并找到其对应的基因序列,7个蛋白序列及其对应的基因序列分别做多序列比对,最终挑选GSGTLDA、SMATPH(/Q)V作为引物设计的保守区,设计第二对简并引物,A2-F:5′-AGGWAGYGGKACTCTYGATGC-3′,A2-R:5′-RTTHCCKGCBGCVGCHRCVAC-3′,能够扩增得到大小为372 bp的片段。

2.4 蛋白酶基因PCR扩增结果

以芽孢杆菌CDJYB的全基因组为模板,A1-F、A1-R为引物,成功扩增出一条200～500 bp之间的特异性条带,如图3,而简并引物A2则没有扩增出特异条带(结果未给出)。测序结果经过BLAST得到序列JX504681.1(1053 bp),被确认为目标角蛋白酶基因序列,并通过该序列设计全长引物(去除自身信号肽)CDJYB-28aF:CGGGATCC(BamHI)GCTCAGCCGGCGAAAAAT和CDJYB-28aR:CGCCTCGAG(XhoI)TTATTGAGCGGCAGCTTCGA,其PCR结果如图4所示,得到一个1000 bp左右的条带,大小与JX504681.1接近。

图3 以简并引物A1扩增的PCR产物的电泳检测结果Fig.3 Electrophoresis analysis of PCR products using degenerate primer A1注:M:DNA Marker;1:简并引物A1扩增的PCR产物。

图4 角蛋白酶基因PCR扩增产物的电泳检测结果Fig.4 Electrophoresis analysis of PCR products of keratinase注:M:DNA Marker;1:角蛋白酶基因的PCR扩增产物。

2.5 克隆及表达载体的构建

能够编码完整角蛋白酶的基因通过TA克隆的方式克隆到pGM-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经过菌落PCR初筛,再使用BamHI和XhoI双酶切进行复筛,如图5,角蛋白酶基因成功连接到pGM-T载体获得质粒pGM-T-Ker,且测序结果表明,该基因序列全长1053 bp,与NCBI中Bacilluslicheniformisstrain BBE11-1来源的角蛋白酶基因序列(JX504681.1)一致。将质粒PGM-T-Ker经过双酶切后,回收带有粘性末端的角蛋白酶基因片段,并与带有同样粘性末端的pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21,获得pET-28a-Ker,如图6,证明成功构建表达载体。

图5 PGM-T-Ker双酶切电泳检测结果Fig.5 Electrophoresis analysis of PGM-T-Ker after being double digested注:M:DNA Marker;1:PGM-T-Ker的双酶切产物。

图6 pET-28a-Ker双酶切电泳检测结果Fig.6 Electrophoresis analysis of pET-28a-Ker after being double digested注:M:DNA Marker;1:pET-28a-Ker的 双酶切产物;2:目的基因。

2.6 重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)表达产物的SDS-PAGE分析结果

图7 37 ℃下IPTG诱导后蛋白表达SDS-PAGE分析Fig.7 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE) analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 37 ℃注:M:蛋白质Marker;1:BL21(pET-28a)在37 ℃经诱导总蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃经诱导总蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在37 ℃经诱导总蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃经诱导总蛋白沉淀。

重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃的诱导表达产物SDS-PAGE分析结果如下图7所示,重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)在37 ℃,180 r/min诱导16 h后,角蛋白酶成功以包涵体的形式表达,第4泳道中能够很清晰的看到一条在35.0～45.0 kDa之间的特异性蛋白带,符合理论值39.22 kDa(原始分子质量为35.61 kDa,融合了部分质粒片段)。但是在经过诱导的总蛋白上清中没有检测到任何角蛋白酶活性以及蛋白条带。

2.7 不同温度条件下的蛋白表达SDS-PAGE分析结果

重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)分别在15、20、25、30 ℃四个温度梯度下诱导表达结果如下图8和图9,但是均未发现明显的目的条带,需要进一步进行酶活测定。

图8 15和20 ℃下IPTG诱导后蛋白表达SDS-PAGE分析Fig.8 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE)analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 15 and 20 ℃注:M:蛋白质Marker;1:BL21(pET-28a)在15 ℃经诱导总蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在15 ℃经诱导总蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在15 ℃经诱导总蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在15 ℃经诱导总蛋白沉淀;5:BL21(pET-28a)在20 ℃经诱导总蛋白的上清;6:BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃经诱导总蛋白的上清;7:BL21(pET-28a)在20 ℃经诱导总蛋白沉淀;8:BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃经诱导总蛋白沉淀。

表4 不同温度下诱导的重组菌株总蛋白上清的角蛋白酶酶活Table 4 Keratinase activity of supernatant of total protein in recombinant strain induced by IPTG at different temperatures

2.8 酪氨酸-福林酚反应标准曲线及角蛋白酶酶活测定

根据酪氨酸与福林酚的显色反应,绘制了酪氨酸标准曲线,如图10,得到了换算系数,以及结合酶活测定的方案,得出计算酶活的方程式:(ΔA×4×N)/(0.0068×20)。ΔA为实验组和对照组的吸光值之差,N为酶液的稀释倍数。

图9 25和30 ℃下IPTG诱导后蛋白表达SDS-PAGE分析Fig.9 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE)analysis of protein of BL21 induced by IPTG at 25 and 30 ℃注:M:蛋白质Marker;1:BL21(pET-28a)在25 ℃经诱导总蛋白的上清;2:BL21(pET-28a-Ker)在25 ℃经诱导总蛋白的上清;3:BL21(pET-28a)在25 ℃经诱导总蛋白沉淀;4:BL21(pET-28a-Ker)在25 ℃经诱导总蛋白沉淀;5:BL21(pET-28a)在30 ℃经诱导总蛋白的上清;6:BL21(pET-28a-Ker)在30 ℃经诱导总蛋白的上清;7:BL21(pET-28a)在30 ℃经诱导总蛋白沉淀;8:BL21(pET-28a-Ker)在30 ℃经诱导总蛋白沉淀。

图10 酪氨酸标准曲线Fig.10 Standard curve of tyrosine

重组大肠杆菌在15、20、25、30、37 ℃五个温度水平下,经过16 h诱导后总蛋白的上清的角蛋白酶活性分别被测定,测定结果如下表4,结果显示重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)在20 ℃的条件下诱导,产酶量最高,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL,所以使用20 ℃为重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳诱导温度。

3 结论与讨论

利用多序列比对的方法,从一株能够以羽毛为唯一碳氮源的培养基上生长的芽孢杆菌上成功筛选出其角蛋白酶基因,并运用分子克隆的手段成功构建产角蛋白酶的基因工程菌BL21(pET-28a-Ker),并使用菌落PCR以及双酶切的手段验证连接转化的准确性;使用SDS-PAGE结合酶活测定,确定了重组菌株的最佳产酶温度,确立重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳诱导温度为20 ℃下,在诱导16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL。

本实验成功克隆出未知的芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶基因,在一定程度上证明了简并引物克隆的实用性和准确性,另因这两对简并引物是根据13种芽孢杆菌来源的角蛋白酶序列比对结果而设计,涵盖范围较广,能够定位并扩增出大多数的芽孢杆菌来源的角蛋白酶基因。另一对简并引物A2也成功筛选并克隆出源于Bacilluscereus的角蛋白酶基因。

不同的底物以及工业条件,使得研究者需要去开发更多的不同来源、性质的角蛋白酶,而针对不同种属的微生物,可以设计不同的角蛋白酶简并引物,并建立一个角蛋白酶简并引物库,使得角蛋白酶的研究和开发变得更加方便简单,通过简并引物克隆未知来源目的基因的方法廉价便捷,可推广到扩增其他基因。