基于生物信息学技术探讨宫颈癌肿瘤组织中p53突变、共表达网络及临床转归分析

赵子骞，梁新苗，张飞跃，赵培庆



基于生物信息学技术探讨宫颈癌肿瘤组织中p53突变、共表达网络及临床转归分析

赵子骞，梁新苗，张飞跃，赵培庆

255036 山东，淄博实验中学（赵子骞、梁新苗）；255036 山东，淄博市中心医院妇科（张飞跃），转化医学中心（赵培庆）

利用生物信息学技术探讨 p53 在宫颈癌的突变、共表达网络及在疾病预后中的预测能力，为宫颈癌的诊断与预后判断提供一定的理论基础。

利用癌症基因组图谱数据库对靶标分子 p53 进行检索，发现其突变及可能的作用分子与网络。

p53 基因在宫颈癌中的突变率约为 9%，通过 STRING 在线数据库找到在宫颈癌中与 p53 互作分子 Bcl2，p53 的表达水平与宫颈癌预后呈正相关。

本研究发现了与 p53 共同发挥生物学功能的相关分子 Bcl2，为宫颈癌的早期诊断、靶向治疗及预后判断提供了一定理论基础。

宫颈癌； p53； Bcl2； TCGA数据库； 生存期

宫颈癌虽然可以早期预防，但仍然是癌症相关死亡的主要原因之一，也是位于女性发病率第二的恶性肿瘤。它占全球女性肿瘤相关死亡人数的10% ~ 15%，每年约有 527 600 例新发病例及265 700 例死亡病例[1-2]。虽然超过 90% 的早期阶段宫颈癌可接受标准化治疗从而达到临床治愈标准，但对于晚期宫颈癌患者，特别是已经发生转移的病人预后较差[3-4]。因此，早期准确诊断宫颈癌，发现新的治疗靶点，可大大提高宫颈癌患者生存率及预后水平。

近年来基因芯片技术已被广泛应用于筛选表达基因组中变化较大的基因分子，通过该技术可找到与肿瘤发生发展相关的基因分子、基因表达与通路乃至临床转归情况。p53 基因是目前已知与肿瘤发生相关性最高的基因，有趣的是，大部分肿瘤组织中表达突变型 p53，而在宫颈癌中 p53 主要是野生型[5]。众所周知野生型 p53 一般起抑癌基因功能，而突变型p53 主要起癌基因功能。因此本研究中，课题组在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中利用生物信息学技术，对 297 例宫颈癌病人基因表达谱及 p53 突变情况进行深入分析，同时利用KM plotter 网上分析工具分析 p53 表达与疾病预后生存期的关系，以获取宫颈癌组织中 p53 突变及与p53 相关的差异表达基因，从而为宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供候选生物学标志物。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据来源

TCGA 数据库（http://cancergenome.nih.gov/）是一个具有公共功能的基因组学数据库，由美国国立癌症研究院（NCI）和国立人类基因组研究院（NHGRI）于 2006 年联合成立[6]。该数据库利用大规模测序为主的基因组分析技术，通过广泛合作，深入探讨肿瘤发生发展的分子机制，提高人们对肿瘤发病的认识水平。本研究中，我们利用 cBioportal 网站对来源于 TCGA 数据库的 297 例宫颈癌临床标本进行在线分析，cBioportal 网站为肿瘤基因组研究提供了一个网页页面，可用来浏览、可视化和多维度分析肿瘤基因组数据，为读者提供便于理解和学习的基因组学、流行病学、基因表达和蛋白组学事件[7]，是用更简易手段获取肿瘤研究相关数据的理想工具。

1.2 方法

1.2.1 宫颈癌临床标本的一般资料分析 首先利用 cBioportal 网站提供的在线分析工具分析297 例宫颈癌病人的一般资料，主要包括病例种族、年龄、肿瘤亚型、肿瘤类型、病理分期、突变基因数目等基本信息，以期获得本研究中所涉及的 297 例病例的基本情况。

1.2.2 p53基因在宫颈癌中的突变分析 利用 cBioportal 网站提供的在线分析工具分析 297 例宫颈癌病人标本中抑癌基因 p53 的突变情况。

1.2.3 p53 共表达网络、互相作用分子分析 利用 cBioportal 网站提供的在线分析工具分析 p53 共表达网络分子。分析功能蛋白质之间的相互作用可以提供观察疾病的发生或发展机制，因此我们利用 STRING 在线数据库预测可能与 p53 互作基因的网络构图（STRING，http://string-db.org），经过与 p53共表达网络分子交集，找出可能在宫颈癌中与 p53 互作的分子。

1.2.4 生存期分析 利用 KM plotter 网上分析工具（http://kmplot.com/analysis/）分析 p53 表达与宫颈癌病人生存期的关系，以期发现 p53 对疾病预后的预测能力。

2 结果

2.1 宫颈癌病人一般资料分析

结果如图 1 所示，该数据库病例主要为白色人种，占总数的 68.4%（图 1A）；疾病确诊时的年龄以 40 ~ 50 岁数量最多，可达 80 人，占比约 27%（图 1B）；肿瘤类型中，宫颈鳞状细胞癌占绝大多数（图 1C、D）；肿瘤分级，以 G2 和 G3 期占比最多，分别达到 44.1% 和 39.1%；基因突变数量方面，同时突变有 30 ~ 60 个基因的病例最多，人数可达 70 人。

图 1 宫颈癌病例一般情况分析（A：种族分类；B：诊断年龄分组；C：肿瘤病理亚型分类；D：肿瘤类型占比；E：肿瘤免疫组化分级；F：突变数量占比）

Figure 1 General analysis of patients with cervical cancer(A: Racial classification; B: Diagnosis age grouping; C: Tumor pathology subtype classification; D: Tumor type ratio; E: Tumor immunohistochemical grade; F: Proportion of mutations)

图 2 p53 在宫颈癌肿瘤组织中的突变分析（A：TP53基因突变率；B：TP53基因突变热点；C：TP53基因突变类型）

Figure 2 Mutation analysis of p53 in cervical cancer tumor tissues (A: TP53 gene mutation rate; B: TP53 gene mutation hotspot; C: TP53 gene mutation types)

2.2 p53 基因在宫颈癌中的突变分析

尽管文献[8]已报道宫颈癌中 p53 突变比例较低，为进一步明确，我们在线分析了 p53在本研究群体中的突变情况，结果如图 2 所示，p53 整体突变率为8.3%（图 2A），突变位点以 E285K 处最常见（图 2B）；拷贝数量突变主要以二倍体及微缺失为主（图 2C）。

2.3 p53 互相作用网络分析

利用 cBioportal 共表达分析可得到 p53 共表达基因示意图（图 3A），图 3B 为在线分析的 p53 共表达网络图，我们又利用 STRING 在线数据库预测可能与 p53 互作的基因（图 3C），然后在 p53 共表达基因库中找到可能与 p53 互作基因的重叠基因，进而找到目标基因 Bcl2，该基因表达如表 1 所示，其与 p53 共表达相关性达 0.206（< 0.001），表明在宫颈癌中 p53 可能通过与 Bcl2 相互作用起到生物学功能。

2.4 p53 表达与生存期分析

利用 KM plotter 网上分析工具分析 p53 表达与宫颈癌生存期的关系，绘制 p53 基因表达的生存曲线，cutoff 值设为 median，结果如图 4 所示，p53 表达水平与宫颈癌预后呈正相关关系（= 0.021），结果有显著统计学差异，表明 p53 在宫颈癌中以野生型形式主要起抑癌基因功能。

3 讨论

宫颈癌是全球女性中发病率处于第四位的恶性肿瘤[9]。超过 95% 的恶性宫颈癌患者有人乳头瘤病毒（HPV）感染，约 85% 的死亡发生在不发达国家或发展中国家[10]。众所周知，肿瘤抑制基因 p53 主要负责调节细胞周期，修复受损 DNA 并促使细胞在应激环境下发生细胞凋亡[11]。然而，p53基因大约在 50% 的人类恶性肿瘤中发生突变。有趣的是，大多数宫颈癌患者表达野生型 p53（WT p53）[12]，但小部分患者也表达突变型，由于野生型 p53 与突变型 p53 生物学功能完全不同，因此探明宫颈癌中 p53 突变情况及探讨其可能的作用机制，对宫颈癌发生发展机制的阐明及疾病预后都有较大的临床意义。

图 3 p53 在宫颈癌肿瘤组织中的共表达及互作网络分析（A：p53共表达基因；B：p53 共表达网络；C：p53 互作基因预测）

Figure 3 Co-expression and interaction network analysis of p53 in cervical cancer tumor tissues (A: p53 co-expression genes; B: p53 co-expression network; C: p53 interaction gene prediction)

表 1 p53 互作分子与 p53 的共表达情况

图 4 p53 表达水平预测宫颈癌病人生存期的能力分析

Figure 4 The ability of p53 expression levels to predict survival in patients with cervical cancer

本研究中，首先对来源于 TCGA 数据库的 297 例宫颈癌病人 p53 突变情况进行分析，结果显示 p53 整体突变率约为 9%，与文献报道的数据大致相符，这也说明宫颈癌中主要以野生型 p53 为主，也进一步提示 p53 在宫颈癌中可能与和其他肿瘤类型不同的方式行使生物学功能。宫颈癌中 p53 的突变主要以错意突变为主，突变位点则以 E285K 处最为常见；拷贝数量突变主要以二倍体及微缺失为主。

为进一步探明宫颈癌中 p53 的作用分子与通路，我们利用 cBioportal 共表达分析得到了一系列与 p53 共表达的基因，然后在线分析了 p53 的共表达网络图谱；同时我们又利用STRING 在线数据库预测可能与 p53 互作的基因，然后在可能与 p53 共表达网络基因图谱中找到与 p53 互作基因的重叠基因。结果提示 Bcl2 基因不但与 p53 可以互作，而且两者之间存在共表达现象，Bcl2 与 p53 共表达相关性达 0.206，结果有显著统计学意义，表明在宫颈癌中 p53 可能通过与 Bcl2 相互作用起到生物学功能。Bcl2 是细胞死亡的重要负调控因子，在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡，但在肿瘤发生发展中，肿瘤细胞不可控的增殖增多与凋亡减少，Bcl2 主要起到癌基因的功能[13]。已有文献报道 Bcl2 与 p53 相互影响在肿瘤凋亡中起重要生物学作用[14-15]。因此，p53 可能在宫颈癌中抑制Bcl2 生物学功能，从而发挥抑癌基因功能，但对两者关系还有待进一步阐明。

最后我们利用 KM plotter 网上分析工具分析了 p53 表达与宫颈癌生存期的关系，结果表明 p53 表达水平与宫颈癌预后呈明显正相关关系，进一步提示 p53 在宫颈癌中作为野生型主要起抑癌基因功能。

总之，通过生物信息学分析，我们确凿了 p53 在宫颈癌中的突变及可能的生物学功能；同时构建与 p53 的互作分子作用网络，发现了与 p53 共同发挥生物学功能的相关分子Bcl2，为宫颈癌的早期诊断、靶向治疗及预后判断提供了一定的理论基础。

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Analysis of p53 mutation, co-expression network and clinical outcome in cervical cancer tumor tissues based on bioinformatics technology

ZHAO Zi-qian, LIANG Xin-miao, ZHANG Fei-yue, ZHAO Pei-qing

Shandong Zibo Experimental High School, Shandong 255036, China (ZHAO Zi-qian, LIANG Xin-miao); Department of Gynaecology (ZHANG Fei-yue), Center of Translational Medicine (ZHAO Pei-qing), Zibo Central Hospital, Shandong 255036, China

To explore the role of p53 for its mutation, co-expression network and its prognostic ability in cervical cancer, and to provide a theoretical basis for the diagnosis and prognosis of cervical cancer.

The target molecule p53 was searched using The Cancer Genome Atlas (TCGA) database to identify its mutations, possible molecules and networks.

The mutation rate of p53 gene in cervical cancer was about 9%. The expression level of p53 interacting molecule Bcl2 and p53 in cervical cancer is positively correlated with the prognosis of cervical cancer in STRING database.

This study showes that Bcl2 may play an important biological role together with p53 in cervical cancer, by which to provide a theoretical basis for early diagnosis, targeted therapy and prognosis of cervical cancer.

Cervical cancer; p53; Bcl2; TCGA database; Survival time

ZHAO Pei-qing, Email: bzjzzpq@163.com

山东省自然科学基金面上项目（ZR2015HM031、ZR2014HM 042）；山东省医药卫生科技发展计划(2016WSA03022)

赵培庆，Email：bzjzzpq@163.com

2018-12-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.01.006